李 濤，李小清，張智慧，李 燕，王燕新，田 立，廖圓圓，李增政，劉俊林

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

文山三七塊根的植物組織培養(yǎng)研究

李 濤，李小清，張智慧，李 燕，王燕新，田 立，廖圓圓，李增政，劉俊林＊

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

選擇云南文山三七塊根為外植體，采用全面實(shí)驗(yàn)法或正交實(shí)驗(yàn)法，研究組織培養(yǎng)過程中外植體最佳表面消毒方案和最佳愈傷組織誘導(dǎo)、分化生芽、生根方案.試驗(yàn)結(jié)果表明，三七塊根最佳表面滅菌方案為75%乙醇消毒10s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15min；最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋KT 1.0mg／L＋2，4-D 1.0mg／L，批pH＝5.8；生芽生根培養(yǎng)基可以選擇MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA1.0mg／L NAA＋6-BA 1.0mg／L，pH＝5.8.

文山三七；組織培養(yǎng)；表面消毒；外源激素

三七（Panax notoginseng（BurK.）F.H.Chen）是我國傳統(tǒng)珍貴的中藥材，全國95%左右產(chǎn)自云南文山州，該部分三七又名文山三七.中醫(yī)主要以三七塊根入藥.研究表明，三七主要成分為三七總皂甙、三七素、三七黃酮、三七多糖等，具有改善心腦血管疾病、降血糖、降血脂、降血壓、抗血栓、抗衰老、抗休克、抗炎癥、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)免疫力等作用［1，2］.云南文山三七人工種植產(chǎn)業(yè)中，缺乏優(yōu)質(zhì)三七苗，病蟲害嚴(yán)重，種植困難，產(chǎn)量低，三七原材料及其產(chǎn)品供不應(yīng)求.

采用生物技術(shù)可以獲得三七愈傷組織，進(jìn)而可以進(jìn)行三七組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究，對三七種質(zhì)資源的保護(hù)與利用，三七生理、生化、遺傳、病理等研究有重要作用.目前國內(nèi)外有關(guān)文山三七塊根組織培養(yǎng)的報(bào)道很少.

本實(shí)驗(yàn)選取文山三七塊根為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和愈傷組織生芽、生根誘導(dǎo)研究，并研究外植體表面消毒方案和育苗條件，以期為文山三七組織培養(yǎng)研究提供一定理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體來源

文山三七植株材料購買自云南省文山州三七種植戶，通過快遞送至西北民族大學(xué)榆中校區(qū)生命科學(xué)與工程學(xué)院.

1.1.2 試劑

MS培養(yǎng)基：Solarbio.蔗糖：天津市北辰方正試劑廠.瓊脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所.NAA：上海山浦化工有限公司.6-BA：上海中泰化學(xué)試劑有限公司.KT：上海源葉生物科技有限公司.2，4-D：上海中泰化學(xué)試劑有限公司.無水乙醇：煙臺市雙雙化工有限公司.次氯酸鈉：煙臺市雙雙化工有限公司.

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒方案選擇

選擇生長良好的外植體，流水沖洗干凈，然后用75%乙醇消毒，滅菌水漂洗5次，再用2%次氯酸鈉溶液消毒，滅菌水漂洗5次，乙醇、次氯酸鈉溶液消毒時(shí)間見表1.

表1 外植體消毒試驗(yàn)

將消毒后的外植體接種到MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L，pH值為5.8的培養(yǎng)基（不添加任何外源激素的植物組織培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基），26℃暗培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后，根據(jù)外植體誘導(dǎo)情況和污染率［8］［污染率（%）＝污染的外植體數(shù)／接種的總外植體數(shù)×100］選擇最佳消毒方案.實(shí)驗(yàn)中觀察統(tǒng)計(jì)時(shí)，只要接種外植體的錐形瓶中有一個(gè)單獨(dú)外植體出現(xiàn)肉眼可觀察到的真菌菌落或細(xì)菌菌落即將整瓶外植體認(rèn)定為污染.

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇

外植體采用1.2.1最佳方案進(jìn)行外植體消毒.在參照文獻(xiàn)［3～7］的基礎(chǔ)上，將外植體接種到MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋不同濃度的KT、2，4-D，pH值為5.8的培養(yǎng)基.激素濃度變化如表2所示.26℃ 暗培養(yǎng)觀察誘導(dǎo)情況.實(shí)驗(yàn)中觀察統(tǒng)計(jì)時(shí)，只要未污染的單個(gè)外植體出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織即認(rèn)定該單個(gè)外植體被誘導(dǎo)出愈傷組織.

表2 激素濃度變化

1.2.3 分化培養(yǎng)基選擇

通過無菌操作將愈傷組織團(tuán)塊取下，接種在MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋不同濃度的2，4-D、NAA、6-BA，pH值為5.8的培養(yǎng)基.激素濃度設(shè)置如表3，按L9（34）正交表設(shè)置激素濃度變化，如表4所示.26℃ 暗培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)分化情況.實(shí)驗(yàn)中觀察統(tǒng)計(jì)時(shí)，只要未污染愈傷組織細(xì)胞團(tuán)分化出現(xiàn)肉眼可見的單個(gè)胚狀體，即認(rèn)定該愈傷組織細(xì)胞團(tuán)被誘導(dǎo)分化成功.

表3 激素濃度設(shè)置

表4 激素濃度變化

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒結(jié)果與分析

外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著消毒時(shí)間的增加未污染率升高，但是在未污染的外植體當(dāng)中愈傷組織的誘導(dǎo)率卻降低.這可能與消毒時(shí)間過長導(dǎo)致消毒液對外植體的損害程度加深有關(guān).實(shí)驗(yàn)認(rèn)為三七塊根外植體最適消毒時(shí)間為75%乙醇消毒10s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15min.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示.

表5 外植體消毒結(jié)果

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)得到文山三七塊根最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋KT 1.0 mg／L＋2，4-D 1.0mg／L，pH＝5.8.用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)三七塊根愈傷組織的誘導(dǎo)率為5%，如表6所示.將外植體上長出的愈傷組織切下培養(yǎng)，觀察到愈傷組織細(xì)胞團(tuán)緊密，顏色為淺土黃色，也有一些部分細(xì)胞團(tuán)呈無色或半透明狀，愈傷組織細(xì)胞團(tuán)生長良好，如圖1所示.

表6 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.3 生芽、生根實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)將得到的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA 1.0mg／L＋6-BA 1.0mg／L，pH＝5.8（即表4中第2組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基）進(jìn)行暗培養(yǎng).愈傷組織可以分化形成芽，分化成芽率為6%，并且用該培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)一周左右芽形成莖和葉，如圖2所示.待莖生長到7cm左右，不用誘導(dǎo)生根，可自然長出根須如圖3所示（實(shí)驗(yàn)觀察統(tǒng)計(jì)時(shí)，只要生長出肉眼可見的根須即認(rèn)定為生根；實(shí)驗(yàn)不觀察統(tǒng)計(jì)根須的長度，數(shù)量等指標(biāo)）.自此完整的三七苗形成.

圖1 三七愈傷組織

圖2 正在分化形成莖和葉的芽

圖3 自然形成根和根的放大觀察

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)采用文山三七塊根作為外植體用以進(jìn)行植物組織培養(yǎng)研究，初步得到的最佳外植體表面滅菌方案為75%乙醇消毒10s，滅菌水漂洗5次，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15min，滅菌水漂洗5次.最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋KT 1.0mg／L＋2，4-D1.0mg／L，pH＝5.8.生芽生根培養(yǎng)基可以選擇MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA 1.0mg／L＋6-BA 1.0mg／L，pH＝5.8.

在本實(shí)驗(yàn)中未污染的外植體愈傷組織誘導(dǎo)率較低，最大值僅為5%，分析原因有：①實(shí)驗(yàn)材料三七植株是以網(wǎng)購形式從云南省文山州三七種植戶購買的，待三七植株由云南省文山州快遞到甘肅省蘭州市西北民族大學(xué)距離采集植株已經(jīng)有3d左右的時(shí)間，且運(yùn)輸過程中苗未進(jìn)行嚴(yán)格的低溫保藏，在運(yùn)輸過程中植株有一定程度損傷，導(dǎo)致外植體活力降低.②三七塊根細(xì)胞本身的脫分化、分裂能力低，在鄭光植［3］、黃勇［7］等人的研究中都提到用三七塊根誘導(dǎo)愈傷組織的成功率低（其文章中未見詳細(xì)數(shù)據(jù)）.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與鄭光植、黃勇等人研究結(jié)果有一定的相似性，所以可能是三七塊根脫分化形成愈傷組織能力低造成的.

實(shí)驗(yàn)使用75%乙醇和2%次氯酸鈉溶液消毒，然后將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：外植體在MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L＋KT 1.0mg／L＋2，4-D 1.0mg／L，pH＝5.8的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最佳.隨著消毒時(shí)間的增加，消毒效果明顯增加，但是，愈傷組織誘導(dǎo)效果卻明顯下降.筆者在綜合考慮誘導(dǎo)率和污染控制的情況下認(rèn)為三七塊根外植體的最適消毒時(shí)間為75%乙醇消毒10s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15min.

實(shí)驗(yàn)通過無菌操作將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基，來研究愈傷組織的分化和生根.實(shí)驗(yàn)中分化培養(yǎng)基含有的三種外源激素，即2，4-D、NAA、6-BA，是參考張智慧［4］、鄭光植［5］、黃勇［7］的研究而制定的實(shí)驗(yàn)方案.針對實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)研究因素，每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素又有3個(gè)水平的情況，為節(jié)約資源和使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有科學(xué)性，實(shí)驗(yàn)采用正交法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用L9（34）正交表設(shè)置激素濃度變化.分析本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①用培養(yǎng)基MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂8g／L瓊脂＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA 1.0mg／L＋6-BA 1.0 mg／L，pH＝5.8.對愈傷組織進(jìn)行暗培養(yǎng)，愈傷組織可以分化形成芽，再繼續(xù)培養(yǎng)一周左右芽形成莖和葉，待莖生長到7cm左右，不用誘導(dǎo)生根，可自然生長出根須.②實(shí)驗(yàn)通過正交找到一個(gè)較好的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織分化，分化率為6%，且能實(shí)現(xiàn)生根.雖然未污染愈傷組織的分化率只有6%，且生根情況不佳，但是該培養(yǎng)基可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)生芽與生根，能大幅度減少工作量，是比較理想的生芽生根培養(yǎng)基.由于本實(shí)驗(yàn)未采用全面實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行誘導(dǎo)，更未將實(shí)驗(yàn)因素的水平細(xì)化研究，所以可能有更適合三七塊根愈傷組織誘導(dǎo)與分化生芽、生根的培養(yǎng)基配方.

［1］何晶.三七的藥理作用及研究進(jìn)展［J］.天津藥學(xué)，2004，16（5）：58-59.

［2］楊志剛，陳阿琴，俞頌東.三七藥理研究新進(jìn)展［J］.上海中醫(yī)藥雜質(zhì)，2005，39（4）：59-62.

［3］鄭光植，王世林.三七愈傷組織的培養(yǎng)［J］.云南植物研究，1989，11（3）：255-262.

［4］張智慧，文國松，蕭鳳回，等.三七組織與細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19（4）：369-372.

［5］鄭光植，王世林，甘煩遠(yuǎn).三七組織培養(yǎng)的建立［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1989，5（1）：64-69.

［6］黃天衛(wèi)，楊莉，韋美麗，等.不同激素配比對誘導(dǎo)三七花蕾愈傷組織影響［J］.文山學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，27（3）：5-7.

［7］黃勇，張鐵，張文生等.三七組織培養(yǎng)研究綜述［J］.文山學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，25（6）：13-15.

S567.236

A

1009-2102（2016）04-0062-05

2016-08-02

2015年西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)本科生科研項(xiàng)目.

＊

李濤（1992—），男（彝族），云南文山人.