鐘建斌，馬 影，聶 聰，張 丹，馬建秀

（西北民族大學醫(yī)學院，甘肅蘭州730030）

納米二氧化硅對人張氏肝細胞毒性作用研究

鐘建斌，馬 影，聶 聰，張 丹，馬建秀＊

（西北民族大學醫(yī)學院，甘肅蘭州730030）

目的：以納米二氧化硅（SiO2）為研究對象，探討其對人張氏肝細胞（Chang liver cells）的毒性作用.方法：透射電子顯微鏡觀察納米SiO2粒徑、形態(tài)及分散性.體外培養(yǎng)人張氏肝細胞，將細胞分為對照組及納米SiO2暴露組.納米SiO2暴露濃度分別為12.5、25、50、100、200（mg·L－1），作用外周全血細胞和張氏肝細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及結構；四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞生存率；DAPI染色觀察細胞核形態(tài)；TRITC-Phalloidin染色觀察細胞骨架微絲結構.結果：與正常對照組相比，納米SiO2引起人張氏肝細胞存活率明顯降低（P＜0.01）；細胞胞體產(chǎn)生皺縮、變圓，細胞核固縮并出現(xiàn)空泡化，細胞骨架微絲結構破壞.結論：納米SiO2作用于人張氏肝細胞會抑制細胞增殖，造成細胞形態(tài)改變，并呈現(xiàn)劑量依賴性.

納米二氧化硅；人張氏肝細胞；細胞骨架；細胞毒性

0 前言

近年來，隨著納米技術的飛速發(fā)展，納米材料在涂料、催化劑、食品添加劑、藥物載體、醫(yī)學成像等領域得到了越來越廣泛的應用［1，2］.納米二氧化硅（silica nanoparticle）作為納米材料的重要一員，其在生產(chǎn)生活的應用中不可避免地向周圍環(huán)境排放［3］.納米SiO2具有空氣動力學直徑小，較微米級顆粒具有更高的表面活性，生物相容性和載體量等特性［4］，故納米SiO2更易通過呼吸、消化、皮膚等粘膜途徑進入機體，經(jīng)過胞吞、內(nèi)化等各類轉運機制進入潛在的致敏靶點，對機體造成毒性反應［5－7］.研究表明，納米SiO2會造成巨噬細胞（RAW264.7）生長抑制、形態(tài)異常、超微結構改變和細胞膜損傷［8］.另有研究發(fā)現(xiàn)，納米顆粒會明顯抑制卵巢細胞（CHO-K1），并造成胞體皺縮、變圓，細胞骨架微絲破壞等毒性反應［9］.肝臟作為人體最重要的解毒器官，其在納米顆粒進入人體過程中發(fā)揮了重要的識別和轉運作用.但是目前國內(nèi)外對納米SiO2造成人正常肝臟細胞毒性的研究較少，本研究選擇人張氏肝細胞（Chang liver cells）為研究對象，通過體外細胞培養(yǎng)觀察納米SiO2對細胞增殖、細胞形態(tài)改變、細胞核變化和細胞微絲結構的影響，旨在從細胞水平研究不同濃度納米SiO2對人張氏肝細胞的毒性作用和可能的作用機制，為探討納米SiO2濃度效應及生物毒性提供安全指導.

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人張氏肝細胞由西北民族大學醫(yī)學院機能實驗室提供.

納米SiO2（10nm）購自中國基材科技有限公司；6孔板購自美國Costar公司；1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），購自美國Sigma公司；DAPI染液購自美國Molecular probes公司；TRITC-Phalloidin羅丹明標記鬼比環(huán)肽購自上海翊圣生物科技有限公司；其他本實驗所用的試劑均為分析純.酶標儀為美國Thermo產(chǎn)品，IX51熒光顯微鏡為日本O-lympus公司產(chǎn)品.

1.2 透射電子顯微鏡觀察納米SiO2的粒徑及分布情況

將納米SiO2溶液用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液配制，終濃度為50mg·L－1，使用超聲振蕩器超聲10min，將其滴到銅網(wǎng)中，在室溫下風干.使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察粒子直徑、分布情況以及形態(tài)，并用Image-Pro plus軟件隨機測定300個粒子并計算得到顆粒平均粒徑.

1.3 細胞培養(yǎng)

人張氏肝細胞株使用含10%FBS的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細胞接種于6孔板24h后用于實驗.加入10nm SiO2懸液，調(diào)整終濃度為12.5、25、50、100、200（mg·L－1），正常對照組加入相同體積的1640培養(yǎng)基.將培養(yǎng)板置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到目標時間.

1.4 人張氏肝細胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)及生長狀況.

1.5 MTT法檢測細胞抑制率

取對倍生長期的人張氏肝細胞，用胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1×108·L－1種植于96孔板，每孔100μL.培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)基并添加納米SiO2懸液，按實驗方法1.3的要求設定正常對照組及5個納米SiO2暴露組，每組設6個復孔.培養(yǎng)24h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT（終濃度為0.5mg／mL），再培養(yǎng)4h，移去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，置搖床避光搖動10min.待結晶完全溶解，490nm下用酶標儀測定各孔吸光度（OD），計算細胞抑制率.

細胞抑制率＝（1－各組OD值÷對照組OD值）×100%

1.6 DAPI染色觀察細胞核結構

調(diào)整PBMC濃度1×109·L－1后接種于6孔板中，每孔1mL.按實驗方法1.3的要求設定正常對照組及5個納米SiO2暴露組，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h.按試劑盒說明書要求對人張氏肝細胞進行細胞核染色，染色結束后置于Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察，與正常對照組進行比較.

1.7 TRITC-Phalloidin染色觀察PBMC微絲

調(diào)整PBMC濃度1×109·L－1后接種于6孔板中，每孔1mL.按實驗方法1.3的要求設定正常對照組及5個納米SiO2暴露組，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h.按試劑盒說明書要求對人張氏肝細胞進行細胞微絲染色，染色結束后置于Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察，與正常對照組進行比較.

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 納米SiO2的形貌及分散性

圖1結果顯示，納米SiO2分布存在輕度聚集，大小較均勻，顆粒形態(tài)呈球形，分散性較好，使用Image–Pro plus軟件分析得到顆粒粒徑為（10.42±1.65）nm.

圖1 透射電子顯微鏡觀察納米SiO2的粒徑及分布情況

2.2 納米SiO2對人張氏肝細胞形態(tài)的影響

圖2結果顯示，與正常對照組相比（圖2A），當納米SiO2暴露濃度為12.5mg·L－1和25mg·L－1時對人張氏肝細胞形態(tài)并不產(chǎn)生明顯影響（圖2B、圖2C）.而當暴露濃度增加至50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體皺縮、變圓，并產(chǎn)生不同程度的細胞碎片，細胞密度明顯降低并脫落（圖2D、圖2E、圖2F）.

圖2 倒置顯微鏡下觀察納米SiO2對人張氏肝細胞形態(tài)的影響

2.3 納米SiO2對人張氏肝細胞增殖抑制率的影響

表1 MTT法檢測納米SiO2對人張氏肝細胞增殖抑制率的影響（±s，n＝6）

表1 MTT法檢測納米SiO2對人張氏肝細胞增殖抑制率的影響（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05,??P＜0.01.

Group Dose(mg·L-1) Inhibitionrates(24h)（%） Inhibitionrates(48h)（%）Control 0 0 0 12.5 39.9±4.1** 43.2±1.8** 25 55.8±4.4** 64.7±1.3** 50 64.6±2.7** 79.2±1.4** 100 68.3±2.1** 81.7±1.6** 200 71.1±0.7** 82.6±1.1** Silica nanoparticle

表1和圖3結果顯示，與正常對照組相比，各濃度的納米SiO2暴露組均可對人張氏肝細胞活性產(chǎn)生明顯的抑制現(xiàn)象.尤其暴露濃度為200mg·L－1，作用細胞24h和48h后，其對細胞的抑制率可分別達到（71.1±0.7）%和（82.6±1.1）%，與正常對照組相比具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）.

圖3 MTT法檢測納米SiO2對人張氏肝細胞增殖抑制率的影響（±s，n＝6）

2.4 納米SiO2對人張氏肝細胞核的影響

圖4結果所示，與正常對照組相比（圖4A），當納米SiO2暴露濃度為12.5mg·L－1和25mg·L－1時對人張氏肝細胞微絲結構無明顯影響（圖4B、圖4C）.而當暴露濃度增加至50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時，人張氏肝細胞細胞核明顯發(fā)生固縮，并出現(xiàn)空泡化，呈現(xiàn)明顯凋亡核現(xiàn)象（圖4D、圖4E、圖4F）.

圖4 DAPI染色觀察納米SiO2對人張氏肝細胞核形態(tài)的影響

2.5 納米SiO2對人張氏肝細胞微絲結構的影響

圖5結果所示，與正常對照組相比（圖5A），當納米SiO2暴露濃度為12.5mg·L－1和25mg·L－1時對人張氏肝細胞微絲結構無明顯影響（圖5B、圖5C）.而當暴露濃度增加至50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時，人張氏肝細胞骨架微絲結構被明顯破壞（圖5D、圖5E、圖5F）.

3 討論

肝臟是納米SiO2的主要靶器官，當納米SiO2進入機體后可通過血液循環(huán)或淋巴液循環(huán)到達肝臟系統(tǒng)，進而造成肝細胞的毒性損傷［10］.納米SiO2的生物學效應與其粒徑和暴露濃度密切相關，粒徑越小，顆粒表面能和比表面積則越大，從而使納米SiO2具有很高的反應活性［11，12］.投射電子顯微鏡結果顯示，本次研究納米SiO2在細胞培養(yǎng)基中存在輕微的團聚現(xiàn)象.這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與納米SiO2存在極高的表面能以及培養(yǎng)過程中細胞釋放的蛋白質(zhì)或培養(yǎng)基中存在的其他成分有關，但相關研究表明納米SiO2進入細胞內(nèi)之后，團聚現(xiàn)象即會消失［13］.研究表明，納米SiO2會導致RAW264.7巨噬細胞貼壁數(shù)量減少，細胞周圍有納米粒子黏附，并造成細胞崩解現(xiàn)象［8］.本研究結果同樣發(fā)現(xiàn)，不同濃度的納米SiO2作用于人張氏肝細胞后，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細胞胞體皺縮變圓，細胞密度明顯降低、脫落，并產(chǎn)生不同程度的細胞碎片.提示納米SiO2作用于人張氏肝細胞后對細胞會造成嚴重的損傷.本研究運用MTT法測定納米SiO2對人張氏肝細胞增殖抑制率時我們發(fā)現(xiàn)，納米SiO2作用于人張氏肝細胞后會明顯抑制細胞的生長，并呈現(xiàn)時間—劑量依賴關系.相類似的研究也同樣表明，納米SiO2作用于人肺腺癌A549細胞后會明顯導致細胞存活率下降，同時呈現(xiàn)時間依賴性［14］.細胞凋亡在組織形態(tài)學上會表現(xiàn)為形成球形或卵球形細胞質(zhì)并出現(xiàn)胞漿碎片細胞核固縮和空泡化［15］.在本次研究中我們觀察到，當納米SiO2暴露濃度為50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時作用于人張氏肝細胞24h后，其細胞核發(fā)生了明顯的固縮和空泡化現(xiàn)象，提示納米SiO2可能誘導了人張氏肝細胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生.在人張氏肝細胞骨架的微絲結構研究中我們也同樣發(fā)現(xiàn)，在高濃度組處理后，人張氏肝細胞骨架微絲發(fā)生斷裂，骨架結構被明顯破壞.相關研究也表明納米顆粒會造成細胞微絲結構的破壞，從而誘導細胞發(fā)生毒性損傷［9］.

圖5 TRITC-Phalloidin染色觀察納米SiO2對人張氏肝細胞微絲結構的影響

本研究主要針對納米SiO2對細胞活性和細胞形態(tài)學的影響，選擇體外細胞培養(yǎng)方法初步探討了納米SiO2對人張氏肝細胞的毒性損傷作用，但其作用的分子生物學機制尚不清晰，需要進一步深入研究.參考文獻：

［1］Hembury M，Chiappini C，Bertazzo S，et al.Gold-silica quantum rattles for multimodal imaging and therapy［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（7）：1959-1964.

［2］Fucikova A，Valenta J，Pelant I，et al.Silicon nanocrystals and nanodiamonds in live cells：photoluminescence characteristics，cytotoxicity and interaction with cell cytoskeleton［J］.RSC Adv，2014，4（20）：10334-10342.

［3］郭玉婷，劉明學，董發(fā)勤.納米二氧化硅細胞毒性效應研究進展［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2014，（05）：405-408.

［4］Passagne I，Morille M，Rousset M，et al.Implication of oxidative stress in size-dependent toxicity of silica nanoparticles in kidney cells［J］.Toxicology，2012，299（2-3）：112-124.

［5］Oberd RG，Oberd RE，Oberd RJ.Nanotoxicology：An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles［J］.Environmental Health Perspectives，2005，113（7）：823-839.

［6］Ye Y，Liu J，Xu J，et al.Nano-SiO2induces apoptosis via activation of p53and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line［J］.Toxicology in vitro，2010，24（3）：751-758.

［7］Kim HW，Ahn EK，Jee BK，et al.Nanoparticulate-induced toxicity and related mechanism in？vitro and in？vivo［J］.Journal of Nanoparticle Research，2008，11（1）：55-65.

［8］吳秋云，唐萌，謝彥昕等.不同粒徑納米二氧化硅的體外細胞膜毒性作用［J］.中國生物醫(yī)學工程學報，2010，29（03）：437-445.

［9］李武珊，陳麗君.金納米粒子對CHO-K1細胞毒性的谷胱甘肽作用機制［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（02）：234-239.

［10］Oberdorster G，Maynard A，Donaldson K，et al.Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials：elements of a screening strategy［J］.Particle and fibre toxicology，2005，2：8.

［11］Mendoza A，Torres-hernandez JA，Ault JG，et al.Silica nanoparticles induce oxidative stress and inflammation of human peripheral blood mononuclear cells［J］.Cell stress ＆chaperones，2014，19（6）：777-790.

［12］Buzea C，Pacheco，Robbie K.Nanomaterials and nanoparticles：Sources and toxicity［J］.Biointerphases，2007，2（4）：MR17-MR71.

［13］Wang S，Lu W，Tovmachenko O，et al.Challenge in Understanding Size and Shape Dependent Toxicity of Gold Nanomaterials in Human Skin Keratinocytes［J］.Chemical physics letters，2008，463（1-3）：145-149.

［14］焦常平，葉亞婧，張淵，等.納米二氧化硅誘導A549細胞損傷及其氧化應激機制［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（06）：995-999.

［15］Elmore S.Apoptosis：a review of programmed cell death［J］.Toxicologic pathology，2007，35（4）：495-516.

R114

A

1009-2102（2016）04-0071-06

2016-08-02

西北民族大學2016年本科生科研項目（URIP16318，UPIP16317）；西北民族大學2016年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610742002）.

＊

鐘建斌（1994—），男（畬族），浙江麗水人.