劉小莉 彭歡歡 趙江濤 夏秀東 劉 源 周劍忠*

1（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014）

2（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

中華絨螯蟹是一種經(jīng)濟(jì)蟹類，又稱河蟹、毛蟹、清水蟹、大閘蟹，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國及東南亞地區(qū)人們十分鐘愛的淡水水產(chǎn)珍品，食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，成為特種水產(chǎn)品中最具代表性和最有影響力的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，以江蘇為例，超百億的“螃蟹經(jīng)濟(jì)”已占江蘇省水產(chǎn)品產(chǎn)值的40%以上。

由于河蟹是季節(jié)性非常強(qiáng)的水產(chǎn)品，只有在每年的農(nóng)歷秋冬之際蟹才膏肥黃滿。河蟹集中上市季節(jié)，市場上經(jīng)常出現(xiàn)大量積壓河蟹，根據(jù)民間傳統(tǒng)說法，河蟹一旦死亡便失去食用價(jià)值，嚴(yán)重影響河蟹產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的提高。因此改變目前市場上單純供應(yīng)鮮活河蟹的鮮銷方式，推進(jìn)河蟹的儲(chǔ)藏和加工，對(duì)河蟹養(yǎng)殖業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。

對(duì)于死亡河蟹不能食用的原因，解釋也不盡相同。有學(xué)者認(rèn)為河蟹死亡初期體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生致病產(chǎn)物“肉毒堿”，但對(duì)肉毒堿的具體成分未見報(bào)道，也有學(xué)者認(rèn)為死蟹失去食用價(jià)值，是因?yàn)楹有窞殡s食性動(dòng)物，以各種魚、蝦、螺、蚌、蠕蟲、蚯蚓、昆蟲及其幼蟲等為食物，因此體內(nèi)含有大量的細(xì)菌，河蟹一旦死亡，體內(nèi)的細(xì)菌就會(huì)大量繁殖，分解蟹肉，產(chǎn)生大量有毒生物胺，引起人體中毒。

目前，對(duì)于河蟹自然死亡后初期生物胺的變化有一些初步的研究和檢測。但對(duì)于企業(yè)用于加工的河蟹在較長儲(chǔ)貨期內(nèi)是否安全，還沒有詳細(xì)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜法研究室溫自然死亡、-40℃速凍后-20℃凍藏條件下的河蟹生物胺含量的變化，并結(jié)合pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、游離氨基酸等指標(biāo)分析河蟹相關(guān)品質(zhì)的變化，從而為評(píng)價(jià)用于加工的凍藏河蟹的食品安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活公河蟹，由常熟市金唐市水產(chǎn)有限公司提供，體質(zhì)量150 g±15 g，由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所鑒定為中華絨螯蟹。

BCA法蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；色胺（Try）、腐胺（Put）、尸胺（Cad）、組胺（His）、酪胺（Tyr）、精胺（Spd）、亞精胺（Spe）標(biāo)準(zhǔn)品，sigma公司；氨基酸混合標(biāo)樣，日本和光公司；丹磺酰氯、丙酮、乙腈（色譜純），南京化學(xué)試劑股份有限公司；其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T25勻質(zhì)分散機(jī)，德國IKA公司；SevenEasy plus pH儀，上海雷磁儀器廠；Waters 2096高效液相色譜儀，美國Waters公司；DW-150低溫試驗(yàn)箱，南京泰斯特試驗(yàn)設(shè)備；DW-4 OL 278醫(yī)用低溫保存箱，海爾集團(tuán)；L-8900氨基酸全自動(dòng)分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

鮮活河蟹用自來水沖洗干凈后瀝水，分組，分別進(jìn)行處理：

1）自然死亡組：將河蟹直接置于室溫條件（25℃±3℃）下，至自然死亡；

2）冷凍儲(chǔ)藏組：設(shè)置低溫試驗(yàn)箱溫度為-40℃，待腔體溫度穩(wěn)定至設(shè)定值后，將溫度探頭插入河蟹腹部中心進(jìn)行凍結(jié)至中心溫度達(dá)-20℃以下，將凍結(jié)好的河蟹裝入保鮮自封袋（厚度0.2 mm），封口，-20℃低溫保存箱中儲(chǔ)藏。

定期取樣，于4℃冰箱中解凍后去除不可食部分，取河蟹腹部及足鉗內(nèi)肉，用于指標(biāo)測定。

1.3.2 pH值的測定

取蟹肉5 g，加入9倍體積（45 mL）煮沸冷卻后的純水，10 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min離心10 min，測定pH值。

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的檢測

采用GB/T 5009.44—2003半微量定氮法進(jìn)行測定，略有改動(dòng)。取樣品5 g，加入20 mL 5%高氯酸，10 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中再加入20 mL高氯酸重復(fù)上述提取步驟2次，合并上清液，定容到65 mL，用于TVB-N的測定。

1.3.4 游離氨基酸含量測定

采用氨基酸全自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定。上述1.3.2中測完pH值的上清液，取適量，加10%三氯乙酸按1∶1稀釋，放置30 min后，離心取上清，過孔徑0.22 μm濾膜后供上機(jī)測定使用。

1.3.5 生物胺的檢測

用0.1 mol/LHCl溶解標(biāo)準(zhǔn)品，配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋為適當(dāng)濃度，保存于棕色瓶中，4℃儲(chǔ)藏備用。

取待測樣品2.0 g，加10 mL（0.4 mol/L）高氯酸，10 000 r/min勻漿30 s，3 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中再次加入10 mL（0.4 mol/L）高氯酸溶液，充分混勻，重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用高氯酸（0.4 mol/L）溶液定容到25 mL，即為生物胺提取液，用于衍生化。

取標(biāo)準(zhǔn)溶液或提取液1 mL進(jìn)行柱前衍生化處理。加入100 μL氫氧化鈉 （2 mol/L）溶液，300 μL飽和NaHCO3溶液和2 mL丹酰氯（丙酮溶解，10 mg/mL）溶液，于40℃反應(yīng) 45 min；反應(yīng)完畢，取出加入100 μL濃氨水，靜置30 min，加入乙腈定容至5 mL，振蕩混勻，取適量的溶液用孔徑0.22 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行生物胺測定。

HPLC檢測條件：Xtimate C18色譜柱(美國Welch公司)，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流動(dòng)相A為水，B為乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 HPLC檢測流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲(chǔ)藏過程中pH值、TVB-N值的變化

不同條件儲(chǔ)藏過程中蟹肉pH值和TVB-N值的測定結(jié)果見表2。由表2可以看出，河蟹肌肉pH值初始值為8.04，在儲(chǔ)藏前9 d內(nèi)pH值變化不大，12 d時(shí)pH值急劇下降，這可能是因?yàn)榍? d河蟹處于鮮活狀態(tài)，12 d時(shí)河蟹已死亡，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)動(dòng)物呼吸停止時(shí)，血液停止循環(huán)引起供氧停止，組織呼吸轉(zhuǎn)變成無氧糖酵解途徑，體內(nèi)糖原開始分解并產(chǎn)生乳酸，使肌肉的pH值下降。在冷凍儲(chǔ)藏過程中pH值呈下降趨勢，且前6周下降比較緩慢，12周下降比較快。與室溫貯藏相比，冷凍貯藏可以較長時(shí)間內(nèi)維持河蟹肌肉的pH值。

揮發(fā)性鹽基氮含量（TVB-N值）可反映出蛋白質(zhì)分解程度和腐敗程度。歐盟委員會(huì)法規(guī)及國內(nèi)外多項(xiàng)研究建議水產(chǎn)品的TVB-N值可被消費(fèi)者接受的最高濃度范圍為25 mg/100g～35 mg/100g。不同的水產(chǎn)品對(duì)于TVB-N值的要求不同，根據(jù)GB 2733—2005對(duì)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生要求的規(guī)定，不同水產(chǎn)品中TVB-N含量范圍為：海蟹≤25 mg/100g，海水貝類≤15 mg/100g，海水魚、蝦、頭足類≤30 mg/100g，淡水魚、蝦≤20 mg/100g，煌魚、牡蠣≤10 mg/100g。

由表2可知，處于鮮活狀態(tài)的河蟹TVB-N值變化不大，12 d后急劇上升，說明死亡的河蟹肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生分解造成肌肉的腐敗劣變。冷凍儲(chǔ)藏過程中，河蟹TVB-N值呈上升趨勢，但貯藏18周后TVB-N值仍低于20 mg/100g，說明凍藏儲(chǔ)存可以維持較低的TVB-N值，使河蟹保持較好的新鮮度。

表2 不同儲(chǔ)藏過程中蟹肉pH值和TVB-N值的變化

2.2 不同儲(chǔ)藏過程中游離氨基酸含量的變化

不同條件儲(chǔ)存過程中蟹肉游離氨基酸含量的測定結(jié)果見下頁表3。由表3可知，共檢出河蟹肌肉中游離氨基酸為19種，新鮮樣品中總氨基酸含量為19.361 mg/g，甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸含量比較高，是蟹肉的主要呈味氨基酸。室溫下貯藏，蟹肉中總氨基酸含量在前9 d內(nèi)沒有明顯的變化趨勢，12 d后下降到 10.194 mg/g，下降了47.4%，呈味氨基酸也明顯減少。凍藏過程中，蟹肉中總氨基酸隨時(shí)間的延長呈下降趨勢，下降速度比較緩慢，18周后下降了34%。貯藏過程中氨基酸成分和含量的變化可能是因?yàn)樾啡獾鞍踪|(zhì)發(fā)生分解，結(jié)果表明凍藏可以有效延緩蛋白質(zhì)的分解。

2.3 不同儲(chǔ)藏過程中生物胺含量的變化

生物胺（Biogenic Amine，BA）是一類具有生物活性的低分子質(zhì)量含氮有機(jī)化合物的總稱，廣泛存在于生物體及多種食品當(dāng)中。生物胺是生物體內(nèi)的正?；钚猿煞?，在動(dòng)植物和微生物活性細(xì)胞中發(fā)揮重要的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，適度的生物胺含量有益于健康，如兒茶胺、組胺等可以調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)，控制血壓，但若攝入過量的生物胺，則會(huì)導(dǎo)致食物中毒。組胺被認(rèn)為是最具有毒性的生物胺，被人們廣泛關(guān)注。有研究報(bào)道，尸胺、腐胺、酪胺、組胺為有毒生物胺，如尸胺、腐胺的半數(shù)致死量分別是270 mg/kg、1750 mg/kg；組胺口服8 mg～40 mg就可引起輕微的中毒，而超過100 mg會(huì)引起嚴(yán)重的中毒；酪胺口服超過100 mg時(shí)會(huì)引起偏頭疼，苯乙胺口服超過3 mg時(shí)會(huì)引起偏頭疼。

表3 不同儲(chǔ)藏過程中蟹肉游離氨基酸含量的變化

不同條件儲(chǔ)藏過程中蟹肉生物胺含量的測定結(jié)果見表4。表4結(jié)果顯示，新鮮的蟹肉中共檢測到3種生物胺，分別為腐胺、亞精胺和精胺，總生物胺含量為28.78 mg/kg。室溫下貯藏，前9 d蟹肉中總生物胺含量沒有明顯變化，6 d后有微量組胺生成，可能是組氨酸的分解作用，12 d后腐胺急劇增長，并有尸胺、大量組胺和酪胺的生成，總生物含量達(dá)到1 981.03 mg/kg。凍藏的河蟹隨著時(shí)間延長，總生物胺含量逐漸增加，12周有少量尸胺生成，18周后有少量酪胺生成，說明低溫貯藏可有效抑制螃蟹肌肉總生物胺含量以及腐胺、尸胺、酪胺的產(chǎn)生，延長貨架期。夏文水等人在河蟹死亡后新鮮度變化的研究中發(fā)現(xiàn)，死后的河蟹生物胺含量會(huì)迅速積累，而且組胺速度生成最快，河蟹死后在20℃條件下貯藏，3 h后組胺含量達(dá)到63.34 mg/kg，12 h后達(dá)到73.97 mg/kg，而在4℃條件下貯藏，24 h、72 h后組胺含量分別達(dá)到45.48 mg/kg和91.21 mg/kg。這說明河蟹死亡后生物胺含量上升速度很快，食用死蟹會(huì)出現(xiàn)食物中毒現(xiàn)象。

表4 蟹肉不同儲(chǔ)藏過程中的生物胺含量的變化

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了河蟹自然死亡組和冷凍儲(chǔ)藏組貯藏過程中蟹肉品質(zhì)的變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，河蟹未死亡前pH值和TVB-N值無明顯變化，自然死亡后室溫條件下儲(chǔ)藏過程中河蟹的pH值、TVB-N值急劇上升，總氨基酸含量下降，總生物胺含量增加，達(dá)到1 981.03 mg/kg，且有尸胺、組胺和酪胺的生成。冷凍儲(chǔ)藏的河蟹其pH值和TVB-N值的變化顯著延緩，總氨基酸含量下降緩慢，生物胺含量有所增加，18周后僅達(dá)到41.20 mg/kg，說明凍藏可以有效延緩各指標(biāo)的變化，延長貨架期，保證食用安全性。

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