梁國(guó)偉 牟德華

1（中糧華夏長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北秦皇島066600）2（河北科技大學(xué)，河北石家莊050018）

單寧酸物質(zhì)是維管束植物常見的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于葉、芽、種子，根和莖的組織。單寧酸物質(zhì)具有抗菌活性，這使得植物可以抵御病菌的攻擊，對(duì)草食動(dòng)物也有影響。單寧酸可以使植物內(nèi)的同化作用變得困難，同時(shí)產(chǎn)生一種難聞的味道。單寧酸因其對(duì)人類的健康有益而被大家知道，主要表現(xiàn)為一些生物學(xué)特性，包括抗誘變、抗癌和抗氧化的特性。有研究表明，單寧酸的抗氧化能力和它與銅離子螯合的能力有關(guān)。

核桃中的單寧酸種類有很多，而且不同品種核桃中單寧酸的種類和含量也不相同。研究表明，核桃內(nèi)種皮中的單寧酸含量最高。本文以核桃乳生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物核桃渣為原料，建立其單寧酸的HPLC檢測(cè)方法，以期為核桃渣的綜合利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

酚酸類：咖啡酸，中國(guó)食品藥品檢定研究院；（+）-兒茶素，純度≥94.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；沒(méi)食子酸，，純度≥99.%，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；阿魏酸，純度≥99%，生化試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

類黃酮：無(wú)水槲皮素，純度≥98%，生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁，北京化學(xué)試劑公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈、冰乙酸，均為色譜純；95%乙醇、乙酸乙酯、鹽酸，均為分析純；超純水。

1.1.3 儀器

島津LC-20AT系列高相液相色譜儀，Lc Solution Lite工作站，UV檢測(cè)器，Inertsil ODS-SP反相C18柱（250 mm×4.6 mm）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

將核桃渣粉碎并去除油脂后，過(guò)40目篩，備用。

1.2.2 單寧酸的提取

稱取1 g處理好的核桃渣，按照料液比1∶70，提取液為體積分?jǐn)?shù)60%、pH1.5的乙醇溶液，提取溫度70℃，提取時(shí)間60 min，超聲波的功率是50 W。將提取液進(jìn)行收集、離心、濃縮得到單寧酸的粗提液。后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取相并氮吹至干，再用5 mL甲醇定容，用于HPLC測(cè)定。

2 色譜條件的優(yōu)化

2.1 色譜條件選擇

用2%冰乙酸和乙腈作為流動(dòng)相分離單寧酸物質(zhì)，通過(guò)改變流動(dòng)相的配比以及濃度梯度，柱溫達(dá)到各峰分離的目的。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系的考察

準(zhǔn)確稱取5 mg沒(méi)食子酸、阿魏酸、（+）-兒茶素、咖啡酸、蘆丁、無(wú)水槲皮素，溶于10 mL甲醇溶液中。將質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋成不同的濃度梯度。在已經(jīng)確定的色譜條件下，進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)行HPLC分析。在測(cè)定的過(guò)程中根據(jù)需要及時(shí)調(diào)整濃度。根據(jù)液相色譜的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣量，確定線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。

2.2.2 回收率考察

取已知質(zhì)量濃度的單寧酸提取液加入一定量的各單體酚標(biāo)準(zhǔn)樣品，在已經(jīng)確定的色譜條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算各組分的加標(biāo)回收率。

加標(biāo)回收率（%）=［實(shí)測(cè)值（mg）－樣品中含量（mg）］/添加值（mg）×100%

2.2.3 精密度考察

日內(nèi)精密度：在24 h內(nèi)，將不同質(zhì)量濃度的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液多次進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，每次20 μL，根據(jù)峰面積計(jì)算日內(nèi)RSD值。

日間精密度：取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，在不同的日數(shù)內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算日間RSD值。

2.2.4 穩(wěn)定性考察

準(zhǔn)確量取一定體積的單寧酸提取液，在室溫下靜置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h，根據(jù)已經(jīng)確定的色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算各單體酚峰面積的RSD值。

2.2.5 重復(fù)性考察

準(zhǔn)確量取一定體積的單寧酸提取液，根據(jù)已經(jīng)確定的色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算各單體酚峰面積的RSD值。

2.2.6 最低檢測(cè)限的考察

取一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合溶液，用甲醇進(jìn)行倍比稀釋。以信噪比S/N=3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定該色譜條件下的最低檢測(cè)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件

3.1.1 流動(dòng)相的選擇

分別選擇1%冰乙酸-乙腈、1.5%冰乙酸-乙腈、2%冰乙酸-乙腈等不同的流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，2%冰乙酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，各物質(zhì)的分離度較好，峰形銳，故選擇2%冰乙酸-乙腈作為流動(dòng)相。

3.1.2 柱溫的選擇

柱溫是影響物質(zhì)分離的一個(gè)重要因素。分別考察了25℃、30℃、35℃、40℃等不同的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，30℃時(shí)各物質(zhì)的分離度好，峰形銳，出峰時(shí)間適宜。故測(cè)定柱溫選擇30℃。

3.1.3 洗脫程序的確定

流動(dòng)相A為2%冰乙酸，流動(dòng)相B為乙腈（均過(guò) 0.45 μm有機(jī)膜），進(jìn)樣量 20 μL，流速 1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。梯度洗脫程序見表1。單寧酸標(biāo)品色譜圖見圖1。

表1 單寧酸梯度洗脫程序

圖1 單寧酸標(biāo)品色譜圖

3.2 定性分析

通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行定性分析，結(jié)果見表2。

表2 單體酚物質(zhì)的定性分析

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1 線性關(guān)系

以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算各單體酚物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。通過(guò)表3的數(shù)據(jù)可以看出，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣量和各物質(zhì)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3 單體酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

3.3.2 加標(biāo)回收率

各單體酚物質(zhì)的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可以看出，各物質(zhì)的加標(biāo)回收率在80.66%～108.17%之間，因此該方法測(cè)定結(jié)果可靠。

表4 各單體酚物質(zhì)的加標(biāo)回收率

3.3.3 精密度

日內(nèi)精密度和日間精密度的測(cè)定結(jié)果見表5。由表5可以看出，各多酚物質(zhì)的峰變異系數(shù)均小于10%，故精密度良好，符合測(cè)定的要求。

表5 不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品的日內(nèi)和日間的RSD值

3.3.4 穩(wěn)定性

各多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性結(jié)果見表6。由表6可以看出，各單體酚物質(zhì)的變異系數(shù)均小于10%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性RSD值

3.3.5 重復(fù)性

各多酚物質(zhì)的重復(fù)性結(jié)果見表7。由表7可以看出，各單體酚物質(zhì)的變異系數(shù)均小于10%，重現(xiàn)性良好，符合測(cè)定的要求。

表7 多酚物質(zhì)的重復(fù)性RSD值

3.4 樣品檢測(cè)的結(jié)果

根據(jù)確定的色譜條件測(cè)得核桃渣中的單寧酸含量，結(jié)果見表8。由表8可知，核桃渣中含有沒(méi)食子酸、兒茶素、咖啡酸、蘆丁和槲皮素等多酚物質(zhì)，阿魏酸未檢出。其中沒(méi)食子酸的含量最高，槲皮素的含量最低。

表8 核桃渣中多酚物質(zhì)的含量

4 結(jié)論

以2%冰乙酸和乙腈為流動(dòng)相，調(diào)整比例后進(jìn)行洗脫，各單體酚物質(zhì)的峰得到很好的分離。經(jīng)過(guò)方法學(xué)的驗(yàn)證，各物質(zhì)的線性關(guān)系良好，回收率在80.66%～108.17%之間。方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，測(cè)定結(jié)果可靠。

核桃渣中多酚物質(zhì)的含量均不同。核桃渣中含有沒(méi)食子酸、咖啡酸、兒茶素、槲皮素和蘆丁，其中沒(méi)食子酸的含量最高，槲皮素的含量最低。

［1］ROMANI A，CAMPO M，PINELLI P.HPLC/DAD/ESI-MS analyses and anti-radical activity of hydrolyzable tannins from different vegetal species ［J］.Food Chemistry，2012，130（1）：214-221.

［2］李海洋.核桃青皮有效化學(xué)成分及抑菌性研究［D］.西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

［3］OLIVEIRA I，SOUSA A，F(xiàn)ERREIRA I C，et al.Total phenols，antioxidant potential and antimicrobial activity of walnut（Juglans regia L.）green husks ［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46（7）：2326-2331.

［4］PEREIRA J A，OLIVEIRA I，SOUSA A，et al.Bioactive properties and chemical composition of six walnut（Juglans regia L.）cultivars ［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46（6）：2103-2111.

［5］PEREIRA J A，OLIVEIRA I，SOUSA A，et al.Walnut（Juglans regia L.）leaves:Phenolic compounds，antibacterial activity and antioxidant potential of different cultivars［J］.Food and Chemical Toxicology， 2007，45（11）：2287-2295.

［6］FERNANDEI-AGULLO A，PEREIRAE，F(xiàn)REIRE MS，et al.Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut（Juglans regia L.）green husk extracts［J］.Industrial Crops and Products，2013，42：126-132.

［7］張婷，張虹.山核桃青皮化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.食品科技，2007（5）:116-119.

［8］陳虹霞，王成章，周昊，等.核桃酚類化合物的研究進(jìn)展［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2013，33（1）:130-134.

［9］陳杭君，李興飛，郜海燕，等.山核桃仁多酚組分分析及抗氧化研究［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（1）:61-67.

［10］CARVALHO M，F(xiàn)ERREIRA P J，MENDES V S，et al.Human cancer cell antiproliferative and antioxidant activities of Juglans regia L.，F(xiàn)ood and Chemical Toxicology，2010，48（1）：441-447.

［11］ROBERTO G，ANDRADE J.The antioxidant effect of tannic acid on the in vitro copper-mediated formation of free radicals，Archives of Biochemistry and Biophysics，2005，437（1）：1-9.

［12］萬(wàn)政敏，郝艷賓，楊春梅，等.核桃仁種皮中的多酚類物質(zhì)高壓液相色譜分析 ［J］.食品工業(yè)科技，2007（7）:212-213.

［13］魏靜，郝利平.核桃仁種皮中多酚的提取工藝研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，30（2）:150-153.

［14］劉彬球，陳朝銀，葛鋒，等.核桃渣中油脂和蛋白的水劑法同步提取工藝 ［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（3）:159-162.