梁寶愛(ài) 張素娟 楊 凱

1（國(guó)家農(nóng)副加工產(chǎn)品及白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山西太原030012）

2（山西省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山西太原030012）

黃曲霉毒素B1是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的黃曲霉毒素次生代謝物之一，它被世界衛(wèi)生組織劃定為1類致癌物，毒性比砒霜大68倍，是目前已知霉菌毒素中毒性最強(qiáng)的，黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物、肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。因此，我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于各類食品中黃曲霉毒素B1的限量為 0.5 μg/kg～20 g/kg。

目前，黃曲霉毒素B1依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)，在樣品前處理時(shí)，凈化過(guò)程等僅提供了人工手動(dòng)的前處理凈化參考條件，耗時(shí)長(zhǎng)、誤差大，對(duì)檢驗(yàn)人員身體健康存在安全風(fēng)險(xiǎn)。因此本研究采用多功能凈化平臺(tái)進(jìn)行全自動(dòng)提取凈化處理,經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），韓國(guó)德山藥品工業(yè)（株）；氯化鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氯化鉀（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；吐溫-20，天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純），北京化工廠；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（3 μg/mL），美國(guó) Supelco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Freedom EVO ppSPE型多功能凈化平臺(tái)，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；U3000高效液相色譜儀（熒光檢測(cè)器），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；UGC-45CE型氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；AL104型天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Pribolab型光化學(xué)柱后衍生器，青島普瑞幫生物工程有限公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凈化條件

本研究“多功能凈化平臺(tái)”前處理方法與GB 5009.22—2016中“第三法 高效液相色譜—柱后衍生法”中前處理方法進(jìn)行比較。

準(zhǔn)確移取4 mL已處理好上清液（上清液的制備依據(jù) GB 5009.22—2016中 12.1、12.2），加入46 mL1%吐溫-20的PBS，混勻。

免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后,采用多功能凈化平臺(tái)移取50.0 mL樣品提取液，每次移取提取液2.5 mL，移取 20 次，以 17 μL/s（1 mL/min）的流速使溶液緩慢通過(guò)免疫親和柱后，以空氣吹掃體積3 300 μL過(guò)柱，移取10 mL水，以17 μL/s的淋洗速度淋洗柱子2次，棄去全部流出液，再以空氣吹掃體積3 300 μL使空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確移取2.0 mL甲醇洗脫，以17 μL/s的洗脫速度進(jìn)行洗脫后，以空氣吹掃體積2 000 μL排空親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑贸跏剂鲃?dòng)相定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，用孔徑0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.3.2 色譜條件

流動(dòng)相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）；等梯度洗脫條件：A，68%、B，32%；色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：50 μL；光化學(xué)柱后衍生器；激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱取樣液量及各種流速的選擇

使用多功能凈化平臺(tái)設(shè)備對(duì)流速的精確控制是自動(dòng)化操作的最大優(yōu)勢(shì)，但若嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)要求的流速進(jìn)行過(guò)柱就會(huì)降低過(guò)柱的效率。依據(jù)多功能凈化平臺(tái)的實(shí)際流速控制范圍 4.17 μL/s～4 167 μL/s，分別選取不同樣品、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，選取空氣吹掃體積均為2 000 μL，對(duì)黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)項(xiàng)目取樣量、固相萃取的凈化液、淋洗液、洗脫液3種流速（8 μL/s、17 μL/s、35 μL/s）進(jìn)行試驗(yàn)條件選擇。

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在使用取樣針進(jìn)行移液時(shí)，為了對(duì)目標(biāo)液體和系統(tǒng)液（水）進(jìn)行有效隔離，防止二者接觸后系統(tǒng)液對(duì)目標(biāo)液體的稀釋和污染，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求，移取凈化液體積、淋洗液體積分別為50 mL和20 mL。該多功能凈化平臺(tái)是5 mL的泵，能吸取目標(biāo)液體的體積最大量為4 950 μL，只能通過(guò)多次循環(huán)移液來(lái)完成，而移液循環(huán)次數(shù)又是整數(shù)，因此，為了方便編程和修改程序，采用凈化液體積每次吸取2.5 mL作為移液的最大體積進(jìn)行循環(huán)。而對(duì)于淋洗液為水洗的步驟，使用系統(tǒng)液（水）進(jìn)行，為了提高移液速度，在程序中就設(shè)置一次吸取5 mL，洗脫液吸取2 mL。

根據(jù)對(duì)5類食品中黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)加標(biāo)回收率的情況（見(jiàn)表1）和檢驗(yàn)時(shí)間結(jié)合確定最佳流速條件：黃曲霉毒素B1測(cè)定時(shí)樣液、淋洗液、洗脫液流速控制在17 μL/s（相當(dāng)于流速1 mL/min）。

2.2 進(jìn)入固相萃取柱空氣吹掃體積的選擇

樣液、淋洗液、洗脫液分別過(guò)柱后，均需要空氣吹掃固相萃取柱。原因是第一步樣液過(guò)柱完成后，如直接加入清洗液，柱子中殘留的樣本會(huì)降低清洗液的清洗效果，也降低樣本中待測(cè)物與柱子的結(jié)合程度，會(huì)降低回收率。第二步淋洗液清洗完成后，如直接加入洗脫液，柱子中殘留的清洗液會(huì)降低洗脫液的洗脫效果，降低洗脫效率，進(jìn)而降低回收率的問(wèn)題。第三步洗脫液過(guò)柱，目的是將被測(cè)物全部解析后，待分析。如不進(jìn)行空氣吹掃，就會(huì)直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。為了達(dá)到好的凈化、洗脫效果，在選定多功能凈化平臺(tái)最佳流速參數(shù)的基礎(chǔ)上，分別選取不同樣品、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)項(xiàng)目上樣、淋洗、洗脫后選用3種空氣吹掃體積（1 000 μL、2 000 μL、3 300 μL）進(jìn)行最佳條件的選擇。通過(guò)試驗(yàn)，根據(jù)5類食品中黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)回收率的情況（見(jiàn)表2），確定最佳空氣吹掃體積：黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)項(xiàng)目上樣后空氣吹掃體積、淋洗后空氣吹掃體積均為3 300 μL，淋洗后空氣吹掃體積分別為 2 000 μL。通過(guò)空氣吹掃體積的選擇，既能將柱子中的殘留液排干，又能提高各個(gè)過(guò)程的作用效率，從而能夠達(dá)到很好的洗脫效果。

表1 黃曲霉毒素B1各流速參數(shù)的選擇

表2 黃曲霉毒素B1過(guò)固相萃取柱空氣吹掃體積的選擇

2.3 多功能凈化平臺(tái)取樣針及輔助設(shè)施的選擇

多功能凈化平臺(tái)設(shè)備配備了約15 cm的長(zhǎng)取樣針和約11 cm的短取樣針，根據(jù)配備的細(xì)試管，為了對(duì)待凈化液樣品準(zhǔn)確移取，選擇了長(zhǎng)取樣針進(jìn)行凈化試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)取樣針變形彎曲，在固相萃取柱上卡針、報(bào)警。為了解決報(bào)警、停止試驗(yàn)的情況，現(xiàn)選擇了短取樣針，同時(shí)對(duì)相應(yīng)使用的試管和試管架進(jìn)行了更換，樣液試管采用了離心管，在連續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)過(guò)程中，未發(fā)生報(bào)警、卡針故障。

2.4 多功能凈化平臺(tái)凈化步驟的選擇

使用多功能凈化平臺(tái)設(shè)備處理樣品，在樣本量較大時(shí)，柱活化、上樣順序的選擇尤為重要。在開(kāi)始試驗(yàn)設(shè)定凈化步驟程序時(shí)，對(duì)所有固相萃取柱進(jìn)行活化，然后進(jìn)行取樣，但由于待凈化液樣液量較大，必須多次取樣，同時(shí)考慮已活化的固相萃取柱不能變干。在一次固相抽取8個(gè)樣液后，對(duì)取樣針清洗，再取另一排的8個(gè)樣液，由于交替取不同排的樣液，增加了洗針的程序，增加很長(zhǎng)的處理時(shí)間，同時(shí)增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)不斷試驗(yàn)，對(duì)于不能一次性取完樣液的檢驗(yàn)項(xiàng)目按一次性8個(gè)樣品全部程序處理完，再進(jìn)行下一排8個(gè)樣品的處理。這樣既減少了洗針次數(shù)，縮短了處理時(shí)間，又可使下一步的濃縮步驟提前進(jìn)行。整個(gè)試驗(yàn)相當(dāng)于縮短一半的時(shí)間，保證了準(zhǔn)確性又提高了檢驗(yàn)效率。

2.5 精密度的測(cè)定

根據(jù)樣品基體的復(fù)雜程度和檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，選取了不同有代表性的4類食品樣品，同時(shí)向部分陰性試樣中加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1凈化條件，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)項(xiàng)目加標(biāo)量在 2.0 μg/kg～20 μg/kg范圍時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在 1.45%～5.57%之間，符合 GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[5]中被測(cè)組分含量在0.1 μg/kg～10 mg/kg時(shí)，RSD為4.3%～7.5%的要求。

2.6 多功能凈化平臺(tái)穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)多功能凈化平臺(tái)設(shè)備具有8個(gè)獨(dú)立的移液通道，可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行過(guò)柱操作的特性，選取4種不同基質(zhì)的空白樣品，向試樣中加入質(zhì)量濃度5.0 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，提取后在多功能凈化平臺(tái)上進(jìn)行自動(dòng)化一次性凈化處理，測(cè)定其含量，通過(guò)回收率的變化，確認(rèn)多功能凈化平臺(tái)的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)表4可看出，在進(jìn)行每個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目測(cè)定不同基質(zhì)的樣品檢測(cè)過(guò)程中回收率均在80%以上，變化不明顯，穩(wěn)定性良好。

2.7 準(zhǔn)確度的測(cè)定

為了驗(yàn)證多功能凈化平臺(tái)前處理方法的準(zhǔn)確度，選取不同基體的樣品，加入不同質(zhì)量濃度的各項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1凈化條件，按已確定的凈化條件進(jìn)行處理，做準(zhǔn)確度試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出，黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)項(xiàng)目回收率在75%～105%之間，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中被測(cè)組分含量在＜0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍在60%～120%的要求。

表3 同一樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液或陽(yáng)性樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)（n=6）

表4 8個(gè)獨(dú)立移液通道同時(shí)測(cè)定不同樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)

表5 同一樣品加不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 與國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)方法比較

2.8.1 檢測(cè)數(shù)據(jù)的比較

為了驗(yàn)證該方法的可行性和可靠性，選取了不同具有代表性的樣品，分別采用多功能凈化平臺(tái)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22-2016(第三法)手動(dòng)固相萃取凈化方法進(jìn)行了比較，結(jié)果中見(jiàn)表6。由表6可知，2種方法均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，但本方法回收率基本高于手動(dòng)固相萃取凈化方法，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于手動(dòng)固相萃取凈化方法。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度高、精密度好、穩(wěn)定性好，減少了人為引起的偶然誤差。

表6 多功能凈化平臺(tái)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法回收率及精密度的比較

2.8.2 工作效率的比較

通過(guò)多次試驗(yàn)，使用多功能凈化平臺(tái)進(jìn)行凈化處理的結(jié)果不僅準(zhǔn)確度高、精密度好，而且從表7可看出，多功能凈化平臺(tái)的處理方法凈化時(shí)間短，可節(jié)省3/4的時(shí)間，由原來(lái)的360 min中縮短到90 min。

多功能凈化平臺(tái)全自動(dòng)方式進(jìn)行凈化處理，無(wú)需人員看守，檢驗(yàn)人員可同時(shí)完成其他工作，從而提高工作效率；在保障檢驗(yàn)人員安全方面，通過(guò)平臺(tái)全自動(dòng)進(jìn)行凈化處理，檢驗(yàn)人員避免了直接接觸陽(yáng)性樣品并減少了直接接觸有機(jī)試劑的機(jī)會(huì)，從而使檢驗(yàn)人員的身體安全得到了保障。

表7 多功能凈化平臺(tái)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

2.9 多功能凈化平臺(tái)方法在實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證中的應(yīng)用

2016年在參加食藥總局和認(rèn)監(jiān)委對(duì)黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素M1的能力驗(yàn)證考核中，使用了多功能凈化平臺(tái)的凈化處理方法對(duì)考核樣品進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果均為滿意，充分證明該方法的可行性與可靠性。能力驗(yàn)證考核結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 能力驗(yàn)證考核結(jié)果

3 結(jié)論

采用多功能凈化平臺(tái)建立了一種高效、準(zhǔn)確、安全、環(huán)保的應(yīng)用于食品中黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)的食品檢驗(yàn)自動(dòng)化凈化前處理方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法回收率在81.3%～104.0%，RSD＜6.0%，準(zhǔn)確度高、精密度好，能夠滿足其國(guó)家檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)和GB/T27404—2008的要求。

［1］馬志科，昝林森.黃曲霉毒素危害、檢測(cè)方法及生物降解研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（9）:91-94.

［2］余丹，鄒成義.黃曲霉毒素對(duì)蛋品質(zhì)影響及機(jī)理研究［J］.飼料工業(yè)，2009，30（4）：59-60.

［3］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB2761—2017，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017：1-8.

［4］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 5009.22—2016，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

［5］中華人民共和國(guó)浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局.GB/T 27404—2008，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：3-27.