□ 于喆源 張掖市食品藥品檢驗檢測中心 張 婕 蘭州市食品藥品檢驗所

食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸同時測定的HPLC方法

□ 于喆源 張掖市食品藥品檢驗檢測中心 張 婕 蘭州市食品藥品檢驗所

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸是目前國家允許使用的食品添加劑，很多食品經(jīng)常會幾種同時添加。本文試圖通過對上述幾種物質(zhì)的化學(xué)特征和性質(zhì)進(jìn)行分析，建立同時分析上述4種目標(biāo)物的高效液相色譜分析方法。研究結(jié)果表明：采用水相超聲提取作為前處理手段，采用封尾工藝的C18色譜柱，乙酸鈉緩沖鹽溶液（pH=4.5）-甲醇體系為流動相，梯度洗脫方式，通過二極管陣列檢測器在230 nm、293 nm處同時檢測，可以較好地對4種目標(biāo)物進(jìn)行分析，并且克服了單純等度洗脫糖精鈉保留時間對有機相比例過于敏感的問題和國家標(biāo)準(zhǔn)中脫氫乙酸保留時間漂移，峰形拖尾嚴(yán)重的問題。經(jīng)驗證，此方法回收率、精密度、檢出限、重復(fù)性均良好。

苯甲酸；山梨酸；糖精鈉；脫氫乙酸；高效液相色譜

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸是目前國家允許使用的食品添加劑[1]，它們的分子結(jié)構(gòu)如圖1—4所示。但此類物質(zhì)攝入過多會造成潛在的健康風(fēng)險[2]，所以同時準(zhǔn)確高效地檢測變得愈發(fā)重要?，F(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)中，同時測定多種添加劑的方法較少，這給實際檢驗工作（需要滿足高效準(zhǔn)確的要求）帶來了一定難度。所以，需要開發(fā)改進(jìn)同時檢驗上述4種添加劑的方法[3-6]。

圖1 苯甲酸分子結(jié)構(gòu)（CAS：65-85-0）

圖2 山梨酸分子結(jié)構(gòu)（CAS：110-44-1）

圖3 糖精鈉分子結(jié)構(gòu)（CAS：128-44-9）

目前，同時測定上述4種添加劑的國家標(biāo)準(zhǔn)尚未發(fā)布，部分地標(biāo)采用磷酸鹽緩沖液-甲醇體系的方法，雖然通過增加離子強度實現(xiàn)了分析目的，但對色譜柱壽命存在一定影響且對色譜柱要求較高[7]。為此本文通過對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的化學(xué)特征和性質(zhì)的分析，通過選擇合適的色譜條件及樣品前處理方法，提出改進(jìn)方法，盡可能地達(dá)到穩(wěn)定準(zhǔn)確分析的目的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260型，配有二極管陣列檢測器。萬分之一天平： EL204-IC，瑞士梅特勒。千分之一天平：ML503/02，瑞士梅特勒。離心機：10 000 r/min，TGL-16a高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司。酸度計：梅特勒320型，瑞士梅特勒。甲醇：色譜純，德國默克進(jìn)口。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國sigma公司。其他試劑均為優(yōu)級純。實驗用水為滿足GB/T 6682-2008的一級水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

苯甲酸儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。4 ℃保存，3個月有效。

山梨酸儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。4 ℃保存，3個月有效。

糖精鈉儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。4 ℃保存，3個月有效。

脫氫乙酸儲備液（1.0 mg/mL）∶精密稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用20 mL氫氧化鈉溶液（20 g/L）溶解后用水定容。4 ℃保存，3個月有效。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的苯甲酸儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、?10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的山梨酸儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的糖精鈉儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的脫氫乙酸儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

1.3 樣品處理

圖6 20%甲醇流動相色譜圖

稱取樣品2 g（液體樣品吸取2 g）至50 mL離心管中，精密加水25 mL，超聲處理30 min，然后分別精密加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2.5 mL，振搖，8 000 r/min離心10 min，取上清液，分別用乙酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7[8]，過0.45 μm濾膜后上機。

1.4 色譜條件

C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，采用封尾工藝），乙酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇體系流動相，檢測器波長：293 nm，230 nm。進(jìn)樣量：10 μL，流速1 mL/min，柱溫：40 ℃，保留時間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相與檢測波長的選擇

國家標(biāo)準(zhǔn)采用乙酸銨緩沖液-甲醇體系，在實驗過程中，容易造成山梨酸與脫氫乙酸不能完全被分離，且苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸峰形有明顯拖尾。分析原因，因為流動相體系接近中性環(huán)境，不利于減少上述酸性物質(zhì)的自生解離帶來的與色譜柱未鍵合硅羥基強的次級保留，造成拖尾和保留時間不穩(wěn)定。為了克服以上問題，得到穩(wěn)定的色譜結(jié)果，本文選擇采用pH=4.5的醋酸鈉緩沖液-甲醇體系進(jìn)行分析。檢測波長，對于苯甲酸、山梨酸、糖精鈉依國家標(biāo)準(zhǔn)采用230 nm，脫氫乙酸在上述波長下雖然也有明顯吸收，但在實測樣品時，容易受基質(zhì)峰干擾，故繼續(xù)按國家標(biāo)準(zhǔn)293 nm作為檢測波長。

表1 流動相梯度表

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

表3 加標(biāo)回收率

2.2 洗脫方式選擇

4種被測物中，糖精鈉保留時間對有機相比例敏感，當(dāng)有機相比例大于10%時，洗脫順序依次為糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸。

圖7 梯度洗色譜圖

在使用等度洗脫方式時，采用15%有機相比例，雖然可以獲得較好的分離效果，但是總洗脫時間為30 min左右，如圖5所示，對實際工作中的大批量檢品不適用；采用20%的有機相，總洗脫時間在21 min左右，但糖精鈉洗脫過快，山梨酸和脫氫乙酸的分離度不夠，如圖6所示，在實際樣品檢測中容易被干擾。

所以，經(jīng)過嘗試，本文采用梯度洗脫方式進(jìn)行實驗，梯度變化見表1。

采用如上洗脫方式，如圖7所示，糖精鈉洗脫時間為6.5 min，可以有效避免干擾；同時，山梨酸和脫氫乙酸分離度滿足實際需要，峰形對稱性達(dá)到0.989，無拖尾現(xiàn)象；總洗脫時間為24分鐘，達(dá)到預(yù)期。

2.3 方法檢出限和線性

按1.2所述，配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，以上述色譜條件為實驗條件，以濃度為橫坐標(biāo)（x軸），峰面積為縱坐標(biāo)（y軸）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，并以3倍信噪比計算檢出限，見表2，結(jié)果良好，符合要求。

2.4 精密度與加標(biāo)回收率

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液（均取10 μg/mL），重復(fù)進(jìn)樣7次，測定其峰面積并計算RSD值，小于2.0%，精密度良好。然后取1.2所述儲備液100 μL，加入樣品，按1.3進(jìn)行處理，得到下述結(jié)果，見表3，回收率良好。

3 結(jié)論

通過對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的化學(xué)性質(zhì)分析和實驗，得出在采用乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）-甲醇體系為流動相，梯度洗脫方式，樣品水相超聲提取的情況下，可以得到穩(wěn)定良好的結(jié)果，有效地提高了檢驗效率，適應(yīng)目前食品檢測高效準(zhǔn)確的要求。

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