周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及凋亡相關(guān)基因在傳代細(xì)胞中的表達(dá)

周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

目的驗(yàn)證體外Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞的可行性，探討凋亡及抗凋亡基因在軟骨細(xì)胞傳代中的變化，尋找關(guān)節(jié)軟骨退變老化研究的最適宜靶細(xì)胞。方法在無(wú)菌條件下取6周齡新西蘭大白兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，采用Ⅱ型膠原酶消化并機(jī)械吹打的方法分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行原代、傳代培養(yǎng)；形態(tài)學(xué)觀察時(shí)采用甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定；RT-PCR法檢測(cè)P0～P4代軟骨細(xì)胞煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）、信息沉默因子1（Sirt1）、p53、Bax基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)各代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯微鏡下觀察兔原代軟骨細(xì)胞大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形特征，72h全部貼壁生長(zhǎng)。甲苯胺藍(lán)染色顯示培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色；前3代軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定，增殖力良好；連續(xù)培養(yǎng)至P4代后，絕大部分細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形和不規(guī)則形狀。隨著軟骨細(xì)胞的傳代，NAMPT的表達(dá)量逐漸下調(diào)。與P0代軟骨細(xì)胞相比，Sirt1的表達(dá)量在P1代細(xì)胞中明顯上調(diào)，在P2代細(xì)胞急劇下降至P0代以下，在P3～P4代細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)量逐漸下調(diào)。凋亡基因p53和Bax的表達(dá)量隨著軟骨細(xì)胞的傳代而上調(diào)。前3代軟骨細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；在培養(yǎng)到第4～7天時(shí)，P1～P3代與P4代軟骨細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論采用體外Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是切實(shí)可行的。隨著軟骨細(xì)胞的傳代，抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表達(dá)逐漸下調(diào)，凋亡基因p53、Bax的表達(dá)逐漸上調(diào)。P1～P3代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為研究關(guān)節(jié)軟骨凋亡的細(xì)胞體系是合適的。

軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶信息沉默因子1傳代

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，其主要病變是骨關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)骨質(zhì)增生。軟骨細(xì)胞不僅可以合成、分泌基質(zhì)，而且能控制細(xì)胞外基質(zhì)的分布，是一種多功能細(xì)胞，其凋亡是骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的關(guān)鍵因素。因此，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究應(yīng)從軟骨細(xì)胞本身入手。目前關(guān)于該病的發(fā)病機(jī)制、藥物預(yù)防及治療的研究多在動(dòng)物模型中進(jìn)行，因此從動(dòng)物關(guān)節(jié)中成功獲取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)十分重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)驗(yàn)證Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞的可行性，進(jìn)一步研究軟骨細(xì)胞傳代中凋亡相關(guān)基因的變化，以探究其生物學(xué)特性，為從軟骨細(xì)胞層面開(kāi)展骨關(guān)節(jié)炎研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑6周齡新西蘭大白兔1只，體重0.6kg，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。改良杜氏伊格爾（DMEM）完全培養(yǎng)基、FBS（美國(guó)GibcoBRL公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國(guó)Invitrogen公司），甲苯胺藍(lán)、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），RT-PCR試劑（日本TAKARA公司），cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(2X)（立陶宛MBI Fermentas公司），Trizol抽提試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TAKARA公司）。RT-PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 原代軟骨細(xì)胞提取及培養(yǎng)將新西蘭白兔于耳緣靜脈注射空氣處死。在無(wú)菌操作下沿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，暴露關(guān)節(jié)面；用手術(shù)刀片取關(guān)節(jié)表面軟骨，用含青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的PBS沖洗數(shù)次；移入超凈臺(tái)，將軟骨組織剪碎至1mm3的大小。加入0.25%胰蛋白酶5ml，磁力棒搖蕩消化30min，輕輕吹打棄去上清液，PBS液清洗3次；加入2g/L的Ⅱ型膠原酶5ml并移入消化瓶中，將消化瓶放置恒溫?fù)u箱中，消化3～4h。待大部分細(xì)胞游離時(shí)，經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾；15ml離心管收集細(xì)胞，低溫離心1 000r/min，10min；棄上清液，加入體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞懸液均勻分布。

1.2.2 軟骨細(xì)胞的觀察與鑒定取軟骨細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化特點(diǎn)，并進(jìn)行攝片記錄。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，PBS清洗后多聚甲醛固定10min，甲苯胺藍(lán)染色30min；最后在顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞置于5%CO2混和氣體環(huán)境中，37℃恒溫箱內(nèi)單層培養(yǎng)，隔3d首次換液，傳代培養(yǎng)期間，每2～3d根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換1次完全培養(yǎng)基，待鏡下可觀察到細(xì)胞增殖匯集成片，并鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底。占底面積70%～80%可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，按1∶3的比例接種至75cm2培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為P1代細(xì)胞。傳代培養(yǎng)期間，每隔2～3d根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換1次DMEM完全培養(yǎng)基，待鏡下觀察細(xì)胞增殖匯集成片，并鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底占底面積70%～80%可再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)，標(biāo)記為P2代細(xì)胞。對(duì)P0、P1、P2、P3、P4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因檢測(cè)采用RT-PCR法。Trizol法提取P0～P4代軟骨細(xì)胞RNA并獲得cDNA，冰上混合脫氧核糖核酸嵌合熒光染料（DNA Master SYBR Green I Mix）10μl、上下游引物各0.4μl、雙蒸水5.2μl及cDNA 4μl，輕輕混勻，離心5s后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：50°C預(yù)變性2min，95°C變性10min；95°C退火30s，60°C延伸30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后分析產(chǎn)物溶解曲線(xiàn)判斷反應(yīng)的特異性并通過(guò)2-ΔΔCt得到目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 各代細(xì)胞增殖情況檢測(cè)采用MTT比色法。將傳代細(xì)胞消化且作細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，并接種于96孔培養(yǎng)板中。空白調(diào)零孔加入0.1ml DMEM，其余各孔加入0.1ml體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM；每孔接種細(xì)胞2×103個(gè)，每代接種一板，每板接種8列，共接種5板。各培養(yǎng)板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168h時(shí)取出進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)前4h每孔加入20μl MTT溶液，然后繼續(xù)置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。4h后用移液槍吸掉上清液，加入150μl DMSO，振搖10min，置酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值；待吸光度值≥1時(shí)，停止檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察制備的兔原代軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)狀態(tài)下大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形，72h全部貼壁生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 原代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)（×200）

2.2 軟骨細(xì)胞鑒定培養(yǎng)的P0～P4代軟骨細(xì)胞均可被甲苯胺藍(lán)染色，細(xì)胞呈藍(lán)紫色，細(xì)胞核染色較深，細(xì)胞周?chē)猩倭克{(lán)紫色異染顆粒出現(xiàn)。軟骨細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)胞排列緊密，染色加深，部分細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，同時(shí)可見(jiàn)較多分裂細(xì)胞。連續(xù)培養(yǎng)至P4代后，細(xì)胞增殖速度略有減慢，細(xì)胞形態(tài)由大多呈細(xì)長(zhǎng)形、三角形和多邊形，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?、多邊形或不?guī)則形，見(jiàn)圖2。

圖2 P0～P4代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鑒定（甲苯胺藍(lán)染色，×200）

2.3 軟骨細(xì)胞傳代過(guò)程中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化隨著體外培養(yǎng)代數(shù)的增加，抗凋亡基因NAMPT表達(dá)逐漸下調(diào)，細(xì)胞傳至P4代時(shí)，NAMPT的表達(dá)量?jī)H為P0代軟骨細(xì)胞的3.67%。與P0代軟骨細(xì)胞相比，另一抗凋亡基因Sirt1的表達(dá)在P1代軟骨細(xì)胞中明顯上調(diào)；細(xì)胞傳至P2代時(shí)，該基因的表達(dá)量又急劇下降至P0代以下，P3、P4代軟骨細(xì)胞中的基因表達(dá)量則逐漸下調(diào)。與上述抗凋亡基因相反，凋亡基因p53和Bax的表達(dá)量則隨著軟骨細(xì)胞代數(shù)的增加而上調(diào)，見(jiàn)表1和圖3。

2.4 軟骨細(xì)胞傳代過(guò)程中的增殖情況經(jīng)MTT法檢測(cè)，前3代軟骨細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；在培養(yǎng)第4～7天時(shí)，P1～P3代與P4代軟骨細(xì)胞增殖差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4（插頁(yè)）。

表1 P0～P4代軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

圖3 P0～P4代軟骨細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)變化（注：與P0比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為軟骨退變、骨贅形成、軟骨下骨重塑及關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)[1]。孫鵬等[2]發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CRP78、CCAAT/CHOP表達(dá)升高，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引發(fā)的軟骨細(xì)胞凋亡可能是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的原因之一。在實(shí)際臨床工作中，患者關(guān)節(jié)軟骨的獲得還是相對(duì)困難的，因此我們借助動(dòng)物細(xì)胞來(lái)建立實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)成功地采用體外Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行研究，證明該實(shí)驗(yàn)方法是切實(shí)可行的，且細(xì)胞較為純化、增殖能力強(qiáng)、細(xì)胞表型不易改變。這與閆虎等[3]、劉振峰等[4]的實(shí)驗(yàn)研究一致。

在細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，細(xì)胞增殖與凋亡都離不開(kāi)信號(hào)的傳導(dǎo)，即細(xì)胞增殖或凋亡的刺激信號(hào)通過(guò)細(xì)胞外、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，最后產(chǎn)生應(yīng)答的途徑傳導(dǎo)。近年來(lái)的研究一致認(rèn)為p38信號(hào)通路是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的一條重要上游信號(hào)通路[5]。p38通過(guò)2條途徑使p53蛋白表達(dá)增加，從而引起軟骨細(xì)胞凋亡：一是磷酸化IKK（IκB的一個(gè)上游激酶），從而使NF-κB活化，進(jìn)而增加p53的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；二是直接磷酸化p53的絲氨酸15殘基，穩(wěn)定p53蛋白，使其含量增加。p53通過(guò)誘導(dǎo)促凋亡因子Bax的表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡[6]。與促凋亡因子相反的是抗凋亡因子。Sirt1是Sir2在哺乳動(dòng)物的同源基因，是一種依賴(lài)NAD＋的組蛋白去乙?；?，能與多種轉(zhuǎn)錄因子如p53、Ku70、PGC-1等相互作用，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，與細(xì)胞衰老、凋亡、代謝和增殖分化密切相關(guān)，Takayama等[7]研究證實(shí)Sirt1與人體軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)SRT1720能夠激活Sirt1，從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡。劉軍等[9]發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能激活Sirt1通路，減輕骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中軟骨細(xì)胞的線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞保護(hù)作用。可見(jiàn)，Sirt1對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡具有保護(hù)作用。NAMPT廣泛表達(dá)于人體內(nèi)臟脂肪組織、肌肉、骨骼、肝臟等器官和組織，并表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞，可見(jiàn)該蛋白在生理及病理狀態(tài)下均有重要作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)NAMPT通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1活性控制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和眾多代謝過(guò)程，具有抗凋亡作用[11]。根據(jù)以上文獻(xiàn)報(bào)道，p53、Bax是凋亡基因，而Sirt1、NAMPT是抗凋亡基因。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者成功地建立了體外兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體系，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明抗凋亡基因NAMPT及Sirt1的表達(dá)量隨著軟骨細(xì)胞代數(shù)的增加而下調(diào)，凋亡基因p53及Bax的表達(dá)量隨著軟骨細(xì)胞代數(shù)的增加而上調(diào)。從基因?qū)W角度證實(shí)以上結(jié)果，在細(xì)胞的傳代過(guò)程中，抗凋亡基因和凋亡基因表達(dá)的變化是相反的。此外，顯微鏡下觀察及MTT法也發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖速度隨著傳代逐漸減慢，細(xì)胞形態(tài)也變得不規(guī)則。結(jié)合顯微鏡下結(jié)果和軟骨細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)證實(shí)P1～P3代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為研究關(guān)節(jié)軟骨凋亡的細(xì)胞體系是合適的，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。但是本次實(shí)驗(yàn)最終采用的是兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，若能利用骨科髖關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)蛻變后期行關(guān)節(jié)置換術(shù)取到的人體細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果將更有說(shuō)服力。

筆者前期臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，取自《千金方》的獨(dú)活寄生湯和《醫(yī)林改錯(cuò)》的身痛逐瘀湯的諸藥加以化裁而成的“骨痹活絡(luò)湯”能明顯改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀，并且對(duì)其體內(nèi)炎癥因子NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶-3

等具有明顯下調(diào)作用[12]。上述方劑內(nèi)含有多種中藥及中藥有效成分。本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果僅為細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)，后期可針對(duì)軟骨細(xì)胞退變老化信號(hào)通路影響進(jìn)行深入研究，并可在此研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用上述方劑中不同的中藥或中藥有效成分干預(yù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，研究不同藥物對(duì)細(xì)胞凋亡及信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，從分子學(xué)角度明確“骨痹活絡(luò)湯”中的有效成分及作用，必將有更多的臨床獲益。

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In vitro culture of rabbit articular chondrocytes and expression of apoptosis related genes in passage cells

ZHOU Ye,GAO Yue,WANG Xiaonan,et al.
Department of Comprehensive Health Care,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

ObjectiveTo verify the feasibility of in vitro culture of rabbit chondrocytes with collagenaseⅡdigestion method and to investigate the changes of apoptosis and anti apoptotic genes in chondrocyte passages.MethodsThe knee joint cartilage was obtained under aseptic condition from 6 week-New Zealand white rabbits.The chondrocytes were isolated and digested with type collagenaseⅡand primary culture and subculture were carried out.The articular chondrocytes were identified by morphological observation with toluidine blue staining.RT-PCR method was used to detect the relative expression of NAMPT,Sirt1,P53 and Bax genes in chondrocytes of various generations,and the proliferation of chondrocytes in articular cartilage was detected by MTT method.ResultsUnder the microscope observation of rabbit articular chondrocytes were mostly in oval translucent,short spindle,polygonal appearance,and the adherent growth was almost completely in 72h.Toluidine blue staining showed light blue cytoplasm and deep blue nuclei in cultured chondrocytes.The first 3 generations of chondrocytes showed stable phenotype and good proliferation.In the fourth generation,most of the cells changed to long spindle and irregular-shaped.With the passage of chondrocytes,the expression of NAMPT decreased gradually.Compared with the P0 generation of cartilage cells,the expression of Sirt1 in P1 cells was significantly up-regulate,then decreased rapidly in P2 cells,and down-regulated in P3-P4 cells.The expression levels of apoptotic genes p53 and Bax were up-regulated with the passage of chondrocytes.MTT showed that there was no significant difference in the proliferation of chondrocytes among the first 3 generations(all P＞0.05).When cultured on day 4-7,the proliferation of chondrocytes was significantly different between P1-P3and P4 generations(P＜0.05).ConclusionIt is feasible to culture rabbit articular chondrocytes by collagenase digestion method in vitro.With the passage of chondrocytes,the expression of anti apoptotic genes NAMPT and Sirt1 decreased gradually,and the expression of apoptotic genes P53 and Bax increased gradually.P1-P3 joint chondrocytes are suitable for the study of chondrocyte apoptosis.

Chondrocyte Cultured in vitro NAMPT Sirt1Passage

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-2027

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014ZB079）

310006杭州市第一人民醫(yī)院綜合保健科

高越，E-mail：gy9821@sina.com

2017-08-24）

（本文編輯：陳丹）