曹伏君，葉 寧，章俊杰

( 廣東海洋大學(xué)，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江 524025 )

長(zhǎng)鰭裸頰鯛精巢發(fā)育的組織學(xué)觀察

曹伏君，葉 寧，章俊杰

( 廣東海洋大學(xué)，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江 524025 )

以2月齡至2齡的長(zhǎng)鰭裸頰鯛精巢為材料，采用常規(guī)石蠟切片方法，光鏡下觀察長(zhǎng)鰭裸頰鯛精巢發(fā)生、發(fā)育至成熟的過(guò)程。結(jié)果表明，長(zhǎng)鰭裸頰鯛的精巢為葉型，位于腹腔后上方，尾部沒(méi)有合并。精巢發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期。精細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程也分為6個(gè)時(shí)期。精細(xì)胞的發(fā)育由同步到不同步，最后又同步的變化規(guī)律。為長(zhǎng)鰭裸頰鯛分批排精提供了保障。

長(zhǎng)鰭裸頰鯛；精巢；組織學(xué)

長(zhǎng)鰭裸頰鯛(Lethrinuserythropterus)又名紅鰭龍占，隸屬于鱸形目、鱸亞目、裸頰鯛科、裸頰鯛屬[1]，分布于印度—西太平洋區(qū)，我國(guó)南海亦有分布。其體長(zhǎng)可達(dá)到50 cm以上，主要以軟體動(dòng)物、甲殼類及小魚為食，食性較廣。長(zhǎng)鰭裸頰鯛肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，且抗病力強(qiáng)，是一種優(yōu)良的養(yǎng)殖種類。目前在海南、粵西等地已經(jīng)成功地解決了人工繁殖問(wèn)題，已進(jìn)入大面積的網(wǎng)箱養(yǎng)殖階段[2]。關(guān)于長(zhǎng)鰭裸頰鯛的生物學(xué)研究目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察長(zhǎng)鰭裸頰鯛精巢的性腺發(fā)育，了解其發(fā)育規(guī)律，為長(zhǎng)鰭裸頰鯛的生物學(xué)和人工繁殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)期為2012年4月—2014年4月。樣品魚逐月采自海南省海港良種場(chǎng)和廣東省湛江東海島德海養(yǎng)殖場(chǎng)。共采集199 尾，其中成魚46 尾，幼魚153 尾，體質(zhì)量6.7～39.6 kg，魚齡為2個(gè)月至2年。

1.2 方法

活體取出整個(gè)精巢，將精巢樣本切成小塊(幼魚取整個(gè)精巢)后，波恩氏液固定，系列酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片，蘇木精—伊紅染色。Olympus顯微鏡鏡檢，并進(jìn)行顯微攝影[3]。

2 結(jié) 果

2.1 精巢形態(tài)的發(fā)育及顯微觀察

2.1.1 Ⅰ期精巢

Ⅰ期精巢為初產(chǎn)魚特有，外觀猶如細(xì)線狀，邊緣光滑，半透明，成對(duì)存在但在后端并未合并(圖1a)。精原細(xì)胞數(shù)量很少，且排列較為分散，呈圓形或者橢圓形，核占整個(gè)細(xì)胞的比例較大，染色后核與胞質(zhì)均呈弱嗜堿性。

2.1.2 Ⅱ期精巢

精巢稍微增大，邊緣波浪形，灰白色。精巢約占腹腔1/10的體積，位于腹腔后部，性腺指數(shù)(0.06±0.01)%(圖1b)。此期精巢有兩種情況，一種是繁殖萎縮之后，再待發(fā)育的個(gè)體；另一種是幼魚初次發(fā)育開(kāi)始進(jìn)入生殖周期的個(gè)體?？奢^為明顯地觀察到由結(jié)締組織間隔形成的生精小管，但無(wú)囊腔。組織切片觀察可見(jiàn)，精原細(xì)胞數(shù)目明顯增多，在生精小管中，多個(gè)精原細(xì)胞被結(jié)締組織包裹在一起，排列成束。

2.1.3 Ⅲ期精巢

精巢呈扁片狀，同樣為灰白色，但透明度降低，可明顯看到血絲(圖1c)。精巢占腹腔約1/3的體積，位于腹腔后部靠上，性腺指數(shù)(0.10±0.04)%。此時(shí)的生殖細(xì)胞由精原細(xì)胞分裂為精母細(xì)胞的現(xiàn)象最為活躍，因而數(shù)量進(jìn)一步增加。精細(xì)小管是由精原細(xì)胞和由其分化而形成的初級(jí)精母細(xì)胞共同構(gòu)成，并且在小管中央開(kāi)始出現(xiàn)空腔。此時(shí)可以觀察到精巢細(xì)胞的發(fā)育開(kāi)始出現(xiàn)非同步性。

2.1.4 Ⅳ期精巢

精巢呈乳白色，精巢占腹腔1/2以上的體積，性腺指數(shù)(0.55±0.03)%(圖1d)。此時(shí)精細(xì)小管腔內(nèi)壁的細(xì)胞非同步性表現(xiàn)得更為明顯，由精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞及精子細(xì)胞組成。在一個(gè)精巢斷面內(nèi)，這些發(fā)育不同階段的細(xì)胞形成一個(gè)圓型的細(xì)胞群，一圈圈由外至內(nèi)，從精原細(xì)胞向精子細(xì)胞逐層變態(tài)發(fā)育。其中初級(jí)精母細(xì)胞最大，次級(jí)精母細(xì)胞的體型較小，但染色較深，精子細(xì)胞最小，染色最深。而此期的生精小管逐漸退化消失。

2.1.5 Ⅴ期精巢

Ⅴ期的精巢更加膨大，較軟，乳白色，可以發(fā)育到占據(jù)腹腔2/3以上的體積，性腺指數(shù)(3.58±0.02)%(圖1e)。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值，精小囊消失或融合相通，在精細(xì)小管腔和壺腹腔中聚集著大量成熟的精子，經(jīng)過(guò)蘇木精—伊紅染色后著色最深，可以清楚看見(jiàn)被染成淺紅色的流線形尾巴，而精子的圓形頭部被染成藍(lán)色。

2.1.6 Ⅵ期精巢

經(jīng)過(guò)排出精子后的精巢體積萎縮，因萎縮形成的空腔由脂肪填充，性腺指數(shù)(0.03±0.02)%(圖1f)。而精巢內(nèi)部因精子排出而留下許多空腔，組成精囊壁的細(xì)胞主要是精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，囊腔中仍殘留有少數(shù)衰老退化的精子以及精子細(xì)胞變態(tài)過(guò)程中脫落的細(xì)胞器，此時(shí)精巢的組織結(jié)構(gòu)開(kāi)始慢慢恢復(fù)成為第Ⅱ期精巢的狀態(tài)。

圖1 精巢形態(tài)的發(fā)育的顯微觀察a.Ⅰ期精巢，×40； b. Ⅱ期精巢，×40； c. Ⅲ期精巢，×40； d. Ⅳ期精巢，×4； e.Ⅴ期精巢，×4；f. Ⅵ期精巢，×4.

2.2 精子發(fā)生過(guò)程

2.2.1 精原細(xì)胞增殖期

精原細(xì)胞體積最大，核呈橢圓形，核膜較為清晰，一般具有一個(gè)大而圓的核仁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富的膜層結(jié)構(gòu)等。根據(jù)功能及形態(tài)上的差異，將精原細(xì)胞分為兩類：

第一類精原細(xì)胞是原始的胚胎干細(xì)胞(圖2a)。它只能一直進(jìn)行有絲分裂，而不發(fā)生減數(shù)分裂，主要是為了維持精巢內(nèi)的精原細(xì)胞數(shù)量，較為明顯的特征是核呈卵圓形，中位，染色質(zhì)均勻分散；

第二類精原細(xì)胞則是能夠復(fù)制分裂之后成為初級(jí)精母細(xì)胞(圖2b)。細(xì)胞核呈橢圓型，靠近細(xì)胞的一端，染色質(zhì)相對(duì)濃縮，不均勻。這類精原細(xì)胞多次進(jìn)行分裂(圖2c,d)。

2.2.2 精母細(xì)胞生長(zhǎng)期

精原細(xì)胞分裂形成初級(jí)精母細(xì)胞(圖2e,f)。早期的初級(jí)精母細(xì)胞呈橢圓形，體積為精原細(xì)胞的一半，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜較清晰。生長(zhǎng)期的初級(jí)精母細(xì)胞核質(zhì)致密，細(xì)胞器增加。接近第一次成熟分裂的初級(jí)精母細(xì)胞核膜不如早期清晰，染色體粗絲狀，并進(jìn)行配對(duì)和交換。

2.2.3 精母細(xì)胞成熟期

初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)歷第一次減數(shù)分裂后產(chǎn)生2個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞(圖2g,h) ，此時(shí)細(xì)胞形狀仍保持原有的橢圓形，可觀察到細(xì)胞器大多仍集中在細(xì)胞的一端。之后，次級(jí)精母細(xì)胞則在很短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行第二次減數(shù)分裂，從而產(chǎn)生2個(gè)精子細(xì)胞。

2.2.4 精子細(xì)胞變態(tài)期

精子細(xì)胞較小，橢圓形，核質(zhì)遠(yuǎn)比次級(jí)精母細(xì)胞致密，核膜極不清晰(圖2i,j)。精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列形態(tài)變化，發(fā)育為成熟的精子。初期的精子細(xì)胞外形非常不規(guī)則，核膜同樣不清晰，核內(nèi)染色質(zhì)則逐漸聚合成短條狀。最后，呈橢圓形，鞭毛繼續(xù)保持著向后延長(zhǎng)，形成精子。

2.2.5 精子成熟期

精子呈圓錐狀，分頭、中片、尾三部分(圖2k,l)。頭部大部分被細(xì)胞核占據(jù)。

3 討 論

3.1 精巢發(fā)育分期

要研究魚類性腺發(fā)育和成熟的一般規(guī)律，并且了解其與其他外部因素的關(guān)系，則必須依靠劃分性腺成熟階段，從而鑒別魚的成熟度。我國(guó)學(xué)者一般采用 Meueh[4]原則，即將硬骨魚性腺發(fā)育分為6個(gè)階段。而根據(jù)長(zhǎng)鰭裸頰鯛精巢的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)特征，即通過(guò)觀察其外觀變化、精巢內(nèi)精細(xì)胞的發(fā)育程度及數(shù)量，精細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程和精巢發(fā)育過(guò)程不同，其精巢發(fā)育也為6個(gè)階段，與其他大多數(shù)魚類相似。

3.2 精巢結(jié)構(gòu)類型

根據(jù)精巢結(jié)構(gòu)以及生精細(xì)胞在精巢內(nèi)分布的特點(diǎn)，通常將硬骨魚的精巢結(jié)構(gòu)類型分為2類：小管型和小葉型[5-6]。而葉型精巢的主要特點(diǎn)是：精原細(xì)胞存在于小葉的邊緣處，在發(fā)育分化過(guò)程中，精小囊逐漸向中央的管腔部位移動(dòng)，當(dāng)生殖細(xì)胞發(fā)育為成熟精子后，精小囊破裂精子釋放，進(jìn)入小葉腔內(nèi)再流入輸出管中。因此，成熟精子主要在小葉的中央部位和輸出管內(nèi)。

長(zhǎng)鰭裸頰鯛的精巢與大多數(shù)硬骨魚類的精巢較為相似，呈現(xiàn)為葉型，即其精巢里的精原細(xì)胞主要存在于精小葉的邊緣，精小葉呈輻射狀排列，生精細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中原位發(fā)育，并未向中央部位遷移，每個(gè)精小葉都是直接與輸出管相連。而當(dāng)發(fā)育及變態(tài)成為成熟精子之后，精小囊將會(huì)自行破裂，使精子釋放至小葉腔內(nèi)，在繁殖季節(jié)中，由于充滿精子的精小葉間相鄰的壁破裂，許多小葉腔從而相互連通成精子通道，并且在最靠近輸出管的小葉腔壁開(kāi)口，使成熟精子能順利由此進(jìn)入輸出管。這與一般認(rèn)為的鱸形目特有的管型精巢[7]，如金錢魚(Scatophagusargus)[8]有所不同。但也有其他鱸形目魚類精巢為小葉型，如中華烏塘鱧(Bostrichthyssinensis)[9]。因此可以認(rèn)為，鱸形目中魚類可能存在有多種精巢類型。一般的硬骨魚類其精巢一般在尾端合并，然后開(kāi)口于尿殖腔，呈“Y”型[10]。而長(zhǎng)鰭裸頰鯛的精巢雖同等大小成對(duì)地存在于腹腔后上部，但其后端并未合并連結(jié)，而是分別開(kāi)口通向尿殖腔。

3.3 精子發(fā)育特點(diǎn)

硬骨魚類的精巢結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生在國(guó)內(nèi)已有諸多報(bào)道[11-15]。硬骨魚類在精子發(fā)育過(guò)程中，生殖細(xì)胞經(jīng)歷了3個(gè)主要階段[16]：由精原細(xì)胞分化為精母細(xì)胞，精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂成精子細(xì)胞，精子細(xì)胞通過(guò)形態(tài)變化轉(zhuǎn)變?yōu)榫印慕M織學(xué)切片上可以明顯看到，長(zhǎng)鰭裸頰鯛的生殖細(xì)胞隨著發(fā)育的不斷成熟，同樣經(jīng)歷了這3個(gè)階段。長(zhǎng)鰭裸頰鯛的初級(jí)精原細(xì)胞與一般硬骨魚類[17-18]相似，是精巢中的生精干細(xì)胞，由其分裂形成以后各期的生精細(xì)胞。

在長(zhǎng)鰭裸頰鯛精巢中，精細(xì)胞的發(fā)育出現(xiàn)了由同步到不同步，最后又同步的分批現(xiàn)象，即第Ⅰ期為單一時(shí)相的精原細(xì)胞，表現(xiàn)為同步發(fā)育；而到了第Ⅱ期則以初級(jí)精母細(xì)胞為主，第Ⅲ期是以次級(jí)精母細(xì)胞為主，第Ⅳ期以精子細(xì)胞為主，但第Ⅱ、Ⅲ期卻仍有不同量的其他時(shí)相的精細(xì)胞存在，這表現(xiàn)出其精細(xì)胞發(fā)育的非同步性，非同步性在第Ⅲ期精巢中表現(xiàn)最為明顯，精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞3種細(xì)胞同時(shí)存在；但到了第Ⅳ期后期各時(shí)相精細(xì)胞反而又表現(xiàn)出一種發(fā)育中的追趕現(xiàn)象，待到第Ⅴ期時(shí)全部發(fā)育為成熟的精子，此時(shí)又表現(xiàn)出發(fā)育的同步性。這種現(xiàn)象為長(zhǎng)鰭裸頰鯛分批排精提供了保障。這種現(xiàn)象在其他魚類精子發(fā)育中也常常出現(xiàn)[19-20]。由于到最后已同步，所以精子同時(shí)產(chǎn)出。排精后精巢明顯萎縮，未排出的精子以及脫落的細(xì)胞質(zhì)很快退化并被吸收，進(jìn)入第Ⅵ期后，生殖上皮可明顯看到血管變粗，精巢開(kāi)始充血補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)并且增厚，開(kāi)始生殖細(xì)胞的又一次發(fā)生和形成過(guò)程。翌年再形成一個(gè)新的繁殖周期。

圖2 精子發(fā)生過(guò)程顯微觀察

a.箭頭示附于膜上的精原細(xì)胞，×400； b. 箭頭示精原細(xì)胞，×400； c. 箭頭示精原細(xì)胞增殖期，×100； d. c圖的放大，×200； e. 箭頭示初級(jí)精母細(xì)胞，×100； f. 箭頭示初級(jí)精母細(xì)胞分裂，×400； g. 箭頭示次級(jí)精母細(xì)胞，×100； h. g圖的放大，×400； i. 箭頭示精子細(xì)胞早期，×100； j. 箭頭示精子細(xì)胞，×100； k. 箭頭示精子成熟期，×100； l. k圖的放大，×400.

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ObservationonMicrostructureofTestisinLethrinuserythropterus

CAO Fujun, YE Ning, ZHANG Junjie

( Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China )

In this experiment, gonadogenesis and development was histologically observed in testis ofLethrinuserythropterusfrom 2 months old to 2 years old under a light microscope. The results showed that the testis was leaf in shape and located in the abdominal cavity, without connection in caudal portion. Testicular development is divided into six stages：Ⅰ, testis was specific and looked like a thin line；Ⅱ, testis increased slightly with wavy edges; Ⅲ, testis was flat, whose blood vessels were observed without connection in caudal portion;Ⅳ, testis occupied more than 1/2 in abdominal cavity; Ⅴ, testis was milky white in color, more than 2/3 of abdominal cavity; the volume of Ⅵ， testis atrophied. The entire process of sperm cell development ofL.erythropteruswas broadly divided into six periods： multiplication of spermatogonial cells，growth of spermatocytes，maturation of spermatocytes，emergence of spermatoblasts，maturation of spermatozoon， and degeneration of spermatozoon．During the development of sperm, phenomenon appeared in batches from the synchronization to unsynchronization and then the synchronization， which makes the fish in batches ejaculation provide more chances for fertilization.

Lethrinuserythropterus；spermary；histology

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.009

Q959.4

A

1003-1111(2017)01-0054-06

2015-12-31；

2016-04-25.

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012A020602048)；廣東海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(粵財(cái)農(nóng)[2013]176號(hào))；廣東省普通高校省級(jí)重大科研項(xiàng)目(GDOU2013050219)；湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)(2015A06006).

曹伏君(1967—)，女，教授，碩士；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖基礎(chǔ)生物學(xué).E-mail：1994516@163.com.通訊作者：葉寧(1972—)，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士；研究方向：魚類學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué).E-mail:2590713@163. com.