傅麗容，倪 俊，阮亦麒，董 蓉，史海濤

( 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?71158 )

阿特拉津?qū)t耳龜胚胎發(fā)育及肝臟、腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

傅麗容，倪 俊，阮亦麒，董 蓉，史海濤

( 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?71158 )

為探索除草劑阿特拉津?qū)t耳龜胚胎發(fā)育及肝臟、腎臟組織學(xué)變化的影響，本試驗(yàn)?zāi)M不同含量阿特拉津污染環(huán)境，設(shè)置對照組(蒸餾水)和0.005 mg/cm2、0.025 mg/cm2、0.125 mg/cm23個試驗(yàn)組，在溫度(30±0.5) ℃、相對濕度為85%～90%的條件下孵化紅耳龜受精卵，檢測孵化率、孵化期及肝、腎臟組織結(jié)構(gòu)變化指標(biāo)。結(jié)果表明，0.005 mg/cm2、0.025 mg/cm2的阿特拉津?qū)Ψ趸屎头趸跊]有顯著影響，0.125 mg/cm2組孵化期顯著延長(P<0.01)；試驗(yàn)處理組肝臟和腎臟有不同程度的損傷，0.005 mg/cm2組主要表現(xiàn)增生性病變，0.025 mg/cm2和0.125 mg/cm2組損傷作用加重，主要表現(xiàn)為退行性病變。試驗(yàn)結(jié)果說明，阿特拉津長時間作用紅耳龜受精卵可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩，并導(dǎo)致肝臟和腎臟組織病變。

阿特拉津；臟器；胚胎；紅耳龜

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中除草劑大量使用，已成為嚴(yán)重的環(huán)境安全問題。阿特拉津，又名莠去津，屬三氮苯類除草劑，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，降解速度緩慢，半衰期長等特點(diǎn)[1]。其可隨徑流進(jìn)入養(yǎng)殖水體，對魚類、甲殼類等水生動物具有毒性作用[2-4]。曾報(bào)道施用阿特拉津9年后的土壤中，50%阿特拉津以結(jié)合態(tài)存在，這些殘留物通過自然環(huán)境因素的相互作用無法除去[5]。如果進(jìn)入土壤中的農(nóng)藥含量在數(shù)量和速度上超過土壤的自凈能力，將會對土壤進(jìn)而對整個生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成潛在威脅。

龜鱉動物成體具有堅(jiān)硬的龜甲，有很長的壽命，環(huán)境污染物在其體內(nèi)的蓄積作用與龜?shù)哪挲g大小成正相關(guān)性[6]。其繁殖行為有別于其他動物，卵生親體無孵卵行為，卵殼具有高柔軟性和通透性。野外環(huán)境中，受精卵一般就在隨地而挖的沙穴或土壤穴孵化，孵化期長，孵化環(huán)境理化性質(zhì)的改變顯著影響龜卵胚胎發(fā)育。已有的研究表明，基質(zhì)酸堿度、硝酸鹽脅迫對胚胎發(fā)育有影響，隨著基質(zhì)酸堿度的降低，紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)和中華條頸龜(Mauremyssinensis)受精卵孵化率降低，孵化稚龜非特異性免疫機(jī)能下降[7]；硝酸鹽脅迫抑制孵化稚龜免疫機(jī)能[8]。

鑒于諸多龜鱉動物的野生種群均屬于瀕危物種及其胚胎期對土壤的依賴性，本研究模擬阿特拉津污染的環(huán)境孵化紅耳龜受精卵，研究紅耳龜胚胎發(fā)育生理機(jī)能變化，探討龜鱉類動物胚胎發(fā)育可能受到的潛在危害，為加強(qiáng)農(nóng)藥使用量的管理和保護(hù)瀕危野生動物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 受精卵獲取

試驗(yàn)用受精卵240枚(已受精2～3 d)，于2014年4月9日購自?？阢旝M養(yǎng)殖場。擇取外觀良好、發(fā)育正常、胎盤明顯的受精卵，經(jīng)可孵性鑒別。

1.2.2 阿特拉津配制

根據(jù)美國農(nóng)業(yè)產(chǎn)品和安大略政府推薦，在玉米地使用控制雜草生長的噴灑用量1.479 kg/hm2阿特拉津(0.01 mg/cm2)[9]，設(shè)置3個含量梯度阿特拉津，分別為0.005 mg/cm2、0.025 mg/cm2、0.125 mg/cm2和蒸餾水(空白對照組)。配制方法：孵化盒面積400 cm2，按照試驗(yàn)設(shè)置的含量，相應(yīng)孵化盒阿特拉津添加量分別為2 mg/盒、10 mg/盒、50 mg/盒；稱取阿特拉津，用蒸餾水溶解后(按質(zhì)量比1∶1)與干蛭石充分混合，空白對照組為加等量蒸餾水。

1.2.3 人工孵化

試驗(yàn)前采用1∶5000高錳酸鉀溶液浸泡孵化盒、擦拭培養(yǎng)箱。受精卵隨機(jī)分組，每組30枚，每個孵化盒15枚，2個平行組，龜卵編號。孵化盒規(guī)格25 cm×16 cm×9 cm，底鋪5 cm蛭石，放入受精卵，水平間隔0.5～1 cm依次排放，覆蓋2 cm蛭石。孵化溫度(30±0.5) ℃，保持智能生化培養(yǎng)箱空氣相對濕度為85%～90%，基質(zhì)濕度為6%～8%，在孵化盒2 cm處插入水銀溫度計(jì)，以此處溫度為基準(zhǔn)控溫。每隔2 d檢查孵化基質(zhì)水分含量，及時補(bǔ)水，維持基質(zhì)所需濕度；孵化過程中，適時按順序調(diào)整各孵化盒的位置，減少和避免培養(yǎng)箱內(nèi)溫偏差對孵化的影響。

1.2.4 組織病理學(xué)分析

孵化出殼稚龜暫養(yǎng)3 d，測量相關(guān)形態(tài)學(xué)指標(biāo)。每組解剖16只，取肝臟、腎臟稱量質(zhì)量。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

（2）鉆井設(shè)備及鉆井工具應(yīng)用的精準(zhǔn)化。對鉆井設(shè)備進(jìn)行精準(zhǔn)化升級，如為井隊(duì)配置20m3以上的膠液罐，統(tǒng)一規(guī)范整改加重漏斗、循環(huán)罐標(biāo)尺，實(shí)行二開固控設(shè)備驗(yàn)收制度。

石蠟組織切片制作方法：新鮮樣本放入波恩氏固定液中，24 h以后移入70%酒精內(nèi)固定保存。制作切片時取出放入固定染色液(染核)12 h，分別用70%→80%→90%→100%酒精洗去余色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，滲蠟，包埋，然后按照常規(guī)法制備紅耳龜肝臟和腎臟組織切片，進(jìn)行病理觀察并顯微拍攝。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各計(jì)量資料均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。(1)Kruskal-Wallis多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)和χ2-檢驗(yàn)不同阿特拉津處理對胚胎孵化率的影響；(2)采用單因素方差分析對各組間孵化期和臟器指數(shù)進(jìn)行差異顯著性比較，P<0.05判定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿特拉津?qū)Ψ趸?、孵化期的影?/h3>

孵化稚龜外部形態(tài)觀察、行動能力觀測，各組均未發(fā)現(xiàn)畸形個體。統(tǒng)計(jì)孵化稚龜(表1)，0.025 mg/cm2、0.005 mg/cm2阿特拉津處理組孵化率與對照組相比差異不顯著，0.125 mg/cm2組雖低于對照組，經(jīng)Kruskal-Wallis多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)差異不顯著(χ2=2.05，df=1，P>0.05)。0.025 mg/cm2、0.005 mg/cm2組孵化期與對照組相比，無明顯變化，0.125 mg/cm2組比對照組延長6 d，差異極顯著(P<0.01)。

表1 阿特拉津?qū)κ芫逊趸始胺趸诘挠绊?/p>

注：同一列肩標(biāo)記不同小寫字母表示各組差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記不同大寫字母表示各組差異極顯著(P<0.01)，下同.

2.2 阿特拉津?qū)Ω闻K、腎臟臟器指數(shù)的影響

肝臟臟器指數(shù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P=0.661>0.05，表明各組方差差異不顯著，方差齊性。進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析(表2)，阿特拉津處理組臟器指數(shù)均高于對照組，并隨著用量的升高臟器指數(shù)增大，0.005 mg/cm2、0.025 mg/cm2、0.125 mg/cm2組分別高于對照組1.89%、5.30%和8.71%，0.005 mg/cm2組與對照組差異不明顯，0.025 mg/cm2、0.125 mg/cm2組皆高于對照組和0.005 mg/cm2組，差異極顯著(P<0.01)。

方差齊性檢驗(yàn)?zāi)I臟臟器指數(shù)，P=0.497>0.05，表明各處理組方差差異不顯著，方差齊性。差異顯著性檢驗(yàn)(表2)，各處理組均極顯著低于對照組(P<0.01)，3個處理組間差異顯著(P<0.05)，并隨著處理用量的升高腎臟指數(shù)明顯降低，各處理組分別低于對照組14.29%、21.90%和23.81%。

表2 阿特拉津?qū)Ψ趸升敻闻K、腎臟臟器指數(shù)的影響

2.3 孵化稚龜肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 肝臟組織結(jié)構(gòu)變化

顯微觀察可見，對照組肝細(xì)胞大小勻稱、排列有序、結(jié)構(gòu)清晰、胞漿均勻，細(xì)胞飽滿，未見組織學(xué)病理改變(圖1a)。處理組肝臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化，0.005 mg/cm2組肝細(xì)胞間結(jié)締組織出現(xiàn)斷裂，出現(xiàn)空泡，肝細(xì)胞排列不整齊、細(xì)胞體積變小，胞漿染色不均，現(xiàn)未被伊紅染色的透明小球狀脂肪滴，肝臟出現(xiàn)脂肪性病變(圖1b)。0.025 mg/cm2組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞大小差異明顯，胞漿渾濁程度加重，細(xì)胞界限不清，脂肪滴融合變大，部分肝細(xì)胞的核溶解(圖1c)；0.125 mg/cm2組脂肪滴愈發(fā)增大(圖1d)，偶見肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死出現(xiàn)空泡變性區(qū)域。

圖1 孵化稚龜肝臟組織切片

a：對照組；b：0.005 mg/cm2組(箭頭A示結(jié)締組織斷裂，出現(xiàn)空泡，箭頭B示脂肪滴)；c：0.025 mg/cm2組(箭頭示增大的脂肪滴)；d：0.125 mg/cm2組(箭頭示融合增大的脂肪滴).每張圖片皆為放大400×.

2.3.2 腎臟組織結(jié)構(gòu)變化

顯微觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)，對照組腎小管上皮細(xì)胞排列有序、大小均勻、結(jié)構(gòu)清晰，腎小管管徑較小，上皮細(xì)胞低矮，管腔大，腎小球結(jié)構(gòu)完整(圖2a)。0.005 mg/cm2組腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹，管腔變窄，腎小球未見明顯改變(圖2b)；0.025 mg/cm2組腎小管上皮細(xì)胞腫脹加劇，部分上皮細(xì)胞壞死、脫落，腎小球輕度充血，小管之間距離輕度增寬(圖2c)；0.125 mg/cm2組腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重空泡變性，與基底膜分離或壞死、脫落，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、體積膨大，個別球囊黏連，部分腎小球萎縮、消失(圖2d)。

圖2 孵化稚龜腎臟組織切片

a ：對照組(箭頭示結(jié)構(gòu)正常腎小管)；b：0.005 mg/cm2組(箭頭示腎小球)；c：0.025 mg/cm2組(箭頭示腫脹腎小管)；d：0.125 mg/cm2組(箭頭示腎小球萎縮壞死).每張圖片皆為放大400×.

3 討 論

3.1 阿特拉津?qū)t耳龜受精卵發(fā)育的影響

阿特拉津可通過環(huán)境進(jìn)入動物體內(nèi)，對動物生理過程產(chǎn)生影響，有一定的毒性作用，毒性效應(yīng)表現(xiàn)在誘發(fā)畸形、發(fā)育遲緩、免疫力低下等方面[10]。本試驗(yàn)處理組受精卵孵化率和對照組無顯著差異，無畸形個體且不會使胚胎致死，說明在規(guī)定的噴灑用量范圍內(nèi)，紅耳龜受精卵卵殼和卵膜有一定的阻隔保護(hù)作用。0.125 mg/cm2組紅耳龜?shù)氖芫逊趸谘娱L，胚胎發(fā)育受抑制。已有的研究證實(shí)，阿特拉津可抑制小鼠、魚等紅細(xì)胞生成，降低血液的攜氧能力[11-12]，紅細(xì)胞供氧不足，能量利用率降低，從而增加代謝損耗，因此需要將內(nèi)源性儲能物質(zhì)轉(zhuǎn)化為機(jī)體可利用的能量[2]，因此導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩?？深A(yù)見在野外環(huán)境中，無親體護(hù)卵的孵化期延長，來自于環(huán)境的其他威脅將加大其生存的風(fēng)險。

3.2 阿特拉津?qū)t耳龜稚龜肝、腎重要臟器的影響

梁秋云等[13]檢測阿特拉津及其主要代謝物在大鼠體內(nèi)的分布發(fā)現(xiàn)，阿特拉津在大鼠體內(nèi)被快速且大量地代謝為脫乙基脫異丙基阿特拉津，該代謝產(chǎn)物在各組織中廣泛分布，并能透過血腦屏障，且在肝、腎等部位長時間蓄積。阿特拉津能夠影響哺乳動物和鳥類肝臟中糖元和脂類的代謝，可引起肝炎和脂肪變性[14]。欒新紅等[15-17]對動物臟器功能的影響研究，發(fā)現(xiàn)阿特拉津?qū)Υ笫蟮拇x器官(肝臟、腎臟)具有損傷作用，使其發(fā)生退行性病變，提示肝臟、腎臟可能是阿特拉津作用的靶器官。阿特拉津?qū)τ诩t耳龜胚胎發(fā)育期的肝、腎損傷作用亦非常明顯，0.005 mg/cm2的阿特拉津作用可致孵化稚龜肝、腎臟脂肪的增加，器官相對比重增大，表現(xiàn)為增生性病變，可能阿特拉津經(jīng)過肝臟的代謝，產(chǎn)生的肝毒性物質(zhì)使載脂蛋白減少，甘油三脂轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致肝臟的脂肪變性[18]。阿特拉津超過規(guī)定使用劑量將產(chǎn)生污染脅迫，在代謝過程中可以對機(jī)體組織產(chǎn)生氧化壓力[19]，明顯抑制體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性[2]，過量的自由基攻擊細(xì)胞膜，引起細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物，最終導(dǎo)致整個細(xì)胞功能失常，基因突變，蛋白質(zhì)交聯(lián)，造成細(xì)胞死亡，表現(xiàn)明顯的退行性病變，損傷程度與劑量成正相關(guān)。

通過以上模擬試驗(yàn)，認(rèn)為阿特拉津在規(guī)定使用范圍內(nèi)，對龜鱉動物胚胎期毒性作用不明顯，長時間或過量使用阿特拉津，可致胚胎發(fā)育遲緩，損傷肝、腎重要臟器組織結(jié)構(gòu)。

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EffectsofAtrazineonEmbryonicDevelopmentandHistologicalStructureofLiverandKidneyinRed-earedTurtle(Trachemysscriptaelegans)

FU Lirong, NI Jun, RUAN Yiqi, DONG Rong, SHI Haitao

( College of Life Science, Hainan Normal University, Haikou 571158, China )

To investigate the effects of atrazine on embryonic development and histological changes in liver and kidney in red-eared turtle (Trachemysscriptaelegans), the fertilized eggs of red-eared turtle were incubated in the water containing atrazine at a dose of 0.005 mg/cm2(low-dose group), 0.025 mg/cm2(middle-dose group), 0.125 mg/cm2(high-does group) and distilled water (control group) at (30±0.5) ℃ under the relative humidity range of 85 to 90 percent in a laboratory. During the incubation, the hatching rate, incubation period and histological changes in liver and kidney were observed. The results showed that the incubation period was significantly prolonged in high-dose group whilst the incubation period and hatching rate were no significant effect in both low-dose and middle-dose groups. Also the damaged liver and kidney tissues had hyperplastic lesions in low-dose group and the degenerative changes in the middle-dose and high-dose groups. The findings illustrated that atrazine may lead to developmental delay in the red-eared turtle embryo and to histological lesions in the kidney and liver.

atrazine; viscera; embryo;Trachemysscriptaelegans

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.018

S966.5

A

1003-1111(2017)01-0104-05

2016-02-23；

2016-04-26.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO.31372228)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO.314078).

傅麗容(1964—), 女, 教授; 研究方向：龜鱉動物生理學(xué). E-mail:flr@hainnu.edu.cn.通訊作者：史海濤(1963—)，男，教授；研究方向：兩棲爬行動物生態(tài)學(xué)與保護(hù)生物學(xué).E-mail:haitao-shi@263.net.