顏廷宇 李鑫 丁鐫 畢冬梅 王鑫 劉穎

黑龍江省漢族人群血小板抗原1~17 系統(tǒng)基因多態(tài)性研究*

顏廷宇 李鑫 丁鐫 畢冬梅 王鑫 劉穎

目的 探討黑龍江省漢族人群人類血小板同種抗原（Human platelet alloantigen，HPA）1～17系統(tǒng)基因多態(tài)性及其表達頻率，確定有臨床意義的血小板抗原系統(tǒng)。方法 選擇123例漢族的健康無血緣關(guān)系的人群為研究對象，采用聚合酶鏈-序列特異性引物（PCR-SSP）技術(shù)，對HPA1-17系統(tǒng)等位基因進行分型，分別計算其基因頻率、基因型頻率，并與國內(nèi)外不同人群進行比較。結(jié)果 黑龍江省漢族人群HPA-1a、2a、3a、5a、6a、15a 基因頻率分別是0.987 8、0.959 4、0.682 8、0.971 5、0.983 7、0.479 6，HPA-4a、7a～14 a、16 a和17a均為1.0；HPA-1b 、2b 、3b、5b、6b 、15b 基因頻率分別是0.012 2、0.040 7、0.317 1、0.028 5、0.016 3、0.520 4，未檢測出HPA-4b、7b～14b、16b和17b。統(tǒng)計漢族人群HPA基因組合型及其頻率，發(fā)現(xiàn)共有24種HPA基因組合型，前3種基因組合型頻率均＞10%（占55.28%），其余21種基因組合型的頻率均＜7.5%（44.72%）。結(jié)論 黑龍江省漢族健康人群HPA1～17基因頻率的分布與其他地區(qū)和國家相比具有本地區(qū)人群特點。HPA-3、15系統(tǒng)具有高度多態(tài)性，在隨機血小板輸注中，供受者HPA-3、15 系統(tǒng)不配合率分別為33.93%、37.46%，易發(fā)生同種免疫反應(yīng)。

人類血小板同種抗原 基因型 多態(tài)性

人類血小板同種抗原（Human platelet alloantigen，HPA）是血小板特異性抗原，為常染色體雙等位基因共顯性遺傳，其等位基因位于第5、6、17、22號染色體上[1]。HPA系統(tǒng)存在遺傳多態(tài)性并表現(xiàn)出種族和地域差異，而通過HPA基因多態(tài)性及基因頻率的種族和地域間差異研究，對血小板輸注無效、新生兒同種免疫血小板減少性紫癜、輸血后血小板減少性紫癜等HPA免疫性疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。本文采用PCRSSP技術(shù)，選擇黑龍江省漢族人群為研究對象，研究血小板抗原1～17系統(tǒng)基因多態(tài)性特點，并分析其等位基因頻率。

材料與方法

1 材料 隨機抽取黑龍江省漢族無血緣關(guān)系、健康獻血者標本123例，年齡18～55歲。采集外周靜脈血樣（EDTA抗凝）5 ml。

2 試劑和儀器 TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑（批號k9627，美國 Tiangen公司），HPA（1～17 ）基因檢測試劑盒（批號1202，天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司），核酸蛋白測定儀（Genequant ），PE9700 PCR 擴增儀，BIO-RAD PCR 擴增儀，RUNONE 型電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂XRT）。

3 DNA提取 應(yīng)用TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒，按照操作說明書提取基因組DNA，核酸蛋白測定儀檢測，DNA濃度為40～100 ng/μl，DNA純度A260/A280比值為1.6～1.8。

4 HPA基因分型檢測 應(yīng)用HPA1～17基因檢測試劑盒，采用PCR-SSP方法對HPA1～17共17個抗原系統(tǒng)34個等位基因進行基因分型，操作步驟嚴格按試劑說明書進行。PCR擴增條件為：96℃ 2 min； 96℃ 20 s，65℃ 50 s ，70℃ 60 s ，5個循環(huán)；96℃ 20 s，65℃ 50 s ，72℃ 45 s ，10個循環(huán)； 96℃ 20 s，62℃ 50 s ，72℃ 45 s ，22個循環(huán)；72℃ 延伸5 min，降溫至4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物7 μl轉(zhuǎn)移至 2.5%瓊脂糖凝膠孔，于140 V電壓下電泳15 min，以內(nèi)參質(zhì)控帶和特異擴增產(chǎn)物陽性分型帶清晰分開為準，凝膠成像儀內(nèi)觀察結(jié)果，拍攝成像。對照反應(yīng)格局圖，進行HPA1～17基因型判定。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用直接計數(shù)法計算基因組合型頻率；應(yīng)用SPSS20.0軟件計算卡方值，比較基因型分布期望值與觀察值之間的吻合度，驗證是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗（H-W檢驗）；不同人群間HPA1-17基因頻率多態(tài)性分布的比較采用卡方檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；各系統(tǒng)對偶抗原不配合率計算MP=2ab（1-ab）（a、b分別代表對偶抗原等位基因頻率）。

結(jié) 果

1 HPA基因型頻率及等位基因頻率 123例黑龍江省漢族人群獻血者獲得HPA1～17基因PCR-SSP擴增產(chǎn)物凝膠成像圖，其中1個樣本HPA基因分型檢測結(jié)果見圖1。據(jù)統(tǒng)計分析，HPA-1a、2a、3a、5a、6a、15a 基因頻率分別是0.987 8、0.959 4、0.682 8、0.971 5、0.983 7、0.479 6，HPA-4a、7a～14 a、16 a和17a均為1.0；HPA-1b、2b、3b、5b、6b 、15b 基因頻率分別是0.012 2、0.040 7、0.317 1、0.028 5、0.016 3、0.520 4，未檢測出HPA-4b、7b-14b、16b和17b （表1）。2 黑龍江省漢族與國內(nèi)外不同民族人群的HPA等位基因頻率的比較 黑龍江省漢族人群與本地區(qū)朝鮮族人群比較，HPA-2、HPA-3、HPA-15的基因頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與本地區(qū)蒙古族比較，HPA-3、HPA-5的基因頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與本地區(qū)滿族人群比較，HPA-3基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與武漢人群比較，HPA-3、HPA-5的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與云南漢族人群比較，HPA-3、HPA-15的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與廣州人群比較，HPA-2、HPA-3、HPA-15的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與長春人群比較，HPA-2、HPA-3的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與青島人群比較，HPA-3基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）；與英國人群比較，HPA-1、HPA-5、 HPA-6的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與美國人群比較，HPA-1、HPA-2、HPA-5的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。與日本人群比較，HPA-2、HPA-3基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表1 黑龍江省漢族HPA-1～17基因型和等位基因頻率（n=123）

表2 黑龍江省漢族與國內(nèi)不同民族人群HPA-1～6、15系統(tǒng)等位基因頻率比較

續(xù)表2

表3 黑龍江省漢族與國外人群HPA-1～6系統(tǒng)等位基因頻率比較

討 論

本文通過PCR-序列特異性引物技術(shù)檢測黑龍江省123名漢族隨機健康獻血者的HPA基因，通過統(tǒng)計學(xué)方法分析HPA1～17的基因型分布和等位基因頻率（表1）。HPA等位基因座Hardy-Weinberg平衡吻合度的檢驗結(jié)果均為P＞0.05，表明本研究人群的基因分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。本研究分析發(fā)現(xiàn)黑龍江省漢族HPA 基因有24 種組合型，其中3 種基因組合型頻率＞10%（55.28%），分別是HPA-1a，2a，3a，4a，5a，6a，7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，15ab，16a，17a（23.57%）；HPA-1a，2a，3ab，4a，5a，6a，7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，15ab，16a，17a（21.14%）；HPA-1a，2a，3a，4a，5a，6a，7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，15b，16a，17a（10.57%）；另外21種基因組合型的頻率均＜10%（44.72%），說明黑龍江地區(qū)的HPA基因遺傳背景較接近。HPA1～17 基因型頻率中HPA3、HPA15具有高雜合度，其余主要以aa 純合子為多，ab雜合子少，沒有bb 純合子出現(xiàn)。HPA1～17基因系統(tǒng)中的HPA 1～17a全部表達并呈高頻分布；HPA-b基因中的HPA1b、2b、3b、5b、6b 和15b有表達，其中3b、15b呈高頻分布，而HPA4b、HPA7b～14b、HPA16b 和HPA17b未表達。HPA各系統(tǒng)對偶抗原不配合率越高，提示誘發(fā)同種抗體的潛在可能性也越高。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)黑龍江漢族HPA-3、HPA-15系統(tǒng)不配合率分別為33.93%、37.46% ，遠遠高于HPA其他系統(tǒng)不配合率，表明HPA-3、HPA-15系統(tǒng)發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)免疫抗體的可能性很高，是導(dǎo)致本地區(qū)血小板輸注無效的最主要HPA系統(tǒng)，這與南昌、吉林等地區(qū)的研究結(jié)果一致[10-12]。

本文通過與國內(nèi)外不同地區(qū)HPA-1～6，15系統(tǒng)基因頻率（表2、表3）的比較分析發(fā)現(xiàn)，黑龍江省漢族人群與其他民族、地域HPA基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明黑龍江省漢族HPA基因頻率具有遺傳多態(tài)性，其遺傳多態(tài)性具有種族、地域差異。黑龍江省漢族人群中HPA基因頻率不論與黑龍江本地區(qū)蒙古族、滿族、朝鮮族人群比較（表2），還是與武漢、云南漢族、廣州、長春、青島等地區(qū)人群比較，或者與日本比較（表3），HPA-3系統(tǒng)基因頻率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而與歐、美人群在HPA-3系統(tǒng)基因頻率比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，在HPA-1、HPA-5系統(tǒng)基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。據(jù)文獻報道，HPA-1、 HPA-5是引起白種人免疫性血小板減少的主要血型系統(tǒng)，占免疫性血小板同種抗體發(fā)生率的79%[13]。但HPA -1b基因頻率在亞洲人群中是很低的，這也是亞洲人群輸血后血小板減少性紫癜（NAITP）和輸血后血小板減少性紫癜（PTP）發(fā)生較少的主要原因。不同地區(qū)發(fā)生HPA免疫性疾病的HPA基因不同，證明了HPA 基因的種族多態(tài)性、地域間差異。建立本地HPA已知型的血小板基因庫，可以避免產(chǎn)生HPA 同種免疫抗體，預(yù)防PTP 、NAITP 等HPA同種免疫性疾病，為人類遺傳學(xué)研究提供了有價值的數(shù)據(jù)。

1 Metcalfe P，Watkins NA，Ouwehand WH，et al.Nomenclature of human platelet antigens[J].Vox Sang，2003，85（3）：240-245.

2 陳涵薇，任明，張浩，等．武漢地區(qū)人群血小板特異性基因（HPA-1～17）的多態(tài)性分析[J]. 臨床血液學(xué)雜志，2014，27（8）：634-637.

3 張翔凌，王冬梅，梁格為. 云南省阿昌族人群HPA1～17 基因多態(tài)性的研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2014，30（9）：1161-1164.

4 陳揚凱，葉欣，夏文杰，等．血小板特異性基因（HPA-1～17）在廣州地區(qū)人群中分布的多態(tài)性研究[J]. 遺傳免疫學(xué)，2010，26（8）：699-702.

5 于江虹，楊帆．長春地區(qū)無償獻血者HPA1-6，15基因分型及頻率調(diào)查[J]. 中國輸血雜志，2010，15（S1）：143.

6 焦淑賢，劉曉華，遲曉云，等. 青島地區(qū)漢族人群HPA1-5、15多態(tài)性分布研究[J].中國輸血雜志，2008，21（3）：179-181.

7 Jones D C，Bunce M，F(xiàn)uggle S V，et al. Human platelet alloanti-gens（HPAs）：PCR-SSP genotyping of a UK population for 15HPA alleles[J]. Eur J Immunol Gene，2003，30（6）：415-419.

8 Kim H O，Jin Y，Kickler T S，et al. Gene frequencies of the five major human platelet antigens in African American white，and Korean populations[J].Transfusion，1995，35（10）：863-868.

9 Tanaka S，Taniue A，Nagao N，et al. Simultaneous DNA typing of human platelet antigens 2，3 and 4 by an allele specific PCR method[J]. Vox Sang，1995，68（4）：225-230.

10 孫瑜，李國良，肖莉，等．南昌地區(qū)機采血小板捐獻人群中人類血小板抗原基因多態(tài)性初步分析[J]. 中國輸血雜志，2008，21（9）：700-703.

11 張冬霞．吉林地區(qū)漢族人群血小板抗原系統(tǒng)基因分型研究[J]. 中國輸血雜志，2011，24（10）：869-870.

12 夏蘭，蔡興權(quán)，陳鑫萍，等. 海南島黎族人血小板l～17抗原系統(tǒng)基因多態(tài)性研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2010，27（2）：229-230.

13 Davoren A，Curtis B R，Aster R H，et al. Human platelet antigen-specific alloantibodies implicated in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocy to penia[J]. Transfusion，2004，44（8）：1220-1225.

Genetic Polymorphism of HPA1-17 Alloantigen System in Heilongjiang Han Population

YAN Ting-Yu，Li Xin，Ding Juan，et al. Harbin Blood Center，Harbin150056

Objective To analyze the allele frequencies and the polymorphisms of Human platlet antigen 1 to 17 system in Heilongjiang Han population for determination of their clinical significance. Method PCR-SSP was used for HPA1-17 genotyping among 123 unrelated Han nationality volunteer donors. The genotypes and gene frequencies of the each HPA gene system were calculated，and the difference with other populations were compared. Result The gene frequencies of HPA-1a，2a，3a，5a，6a，15a were 0.9878，0.9594 ，0.6828，0.9715，0.9837，and 0.4796，respectively，and the gene frequencies for all of HPA-4a，7a～14a，16a，17a were found to be 1.0. The gene frequencies of HPA-1b，2b，3b，5b，6b，15b were 0.0122，0.0407，0.3171，0.0285，0.0163，and 0.5204，respectively. HPA-4b and 7b to 14b and 16b to 17b were undetactabl. The study is the first time to investigate the assortment of HPA genes and their frequencies. The 24 assortment systems were found in Heilongjiang Han population，and only 3 of HPA gene frequencies more than 10%，and 21 less than 7.5% were noted. Conclusion Distribution of the allele polymorphisms of HPA 1-17 in Heilongjiang Han population was featured compared with other regions and countries. The system of HPA-3，15 in Han population with highpolymorphism in that the incompatibility rates of donor recipient HPA-3，15 were 33.93% and 37.46% in random platelets infusion.

Human platelet antigens Genotype Polymorphism

R457.1 Q343.1

A

1671-2587（2017）06-0623-05

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.028

*本課題受2012年度黑龍江省衛(wèi)生廳科技計劃課題（No.2012-081）資助

150056 黑龍江省哈爾濱市血液中心輸血研究所

顏廷宇（1983–），女，黑龍江拜泉人，主管技師，學(xué)士，主要從事輸血醫(yī)學(xué)、免疫遺傳學(xué)研究工作，（Tel）0451-82437137。

劉穎，女，主任技師，主要從事輸血醫(yī)學(xué)、免疫遺傳學(xué)研究工作，（E-mail）liuying54609@126.com。

2017-08-01）

（本文編輯：王敏）