談維

·血型與臨床·

RhD（-）無償獻(xiàn)血者中RhD表型與基因型檢測情況分析*

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目的 尋找一種有效針對無償獻(xiàn)血者的RhD血型基因定型方法。方法 對30例RhD（–）無償獻(xiàn)血者血液樣本進(jìn)行RhD基因定型、弱D 檢測和RhCE基因定型。應(yīng)用熒光定量PCR檢測RHD啟動子、第4內(nèi)含子，以及第7、10外顯子。結(jié)果 30例RhD（–）無償獻(xiàn)血者中，21例未檢測到RHD基因，2例為雜交型，其余7例存在RHD啟動子、第4內(nèi)含子和第7、10外顯子，其中5例為DEL型，1例為弱D，1例為部分D。30例無償獻(xiàn)血者的RhCE基因型為，20例C–E–c+e+，6例C+E–c+e–，2例C+E–c+e+，1例C–E+c+e–。結(jié)論 采用RHCE分型作為Rh（–）定性的篩選檢查，能較好地區(qū)分D變異體。

RHD 基因分型 無償獻(xiàn)血

抗-D抗體能導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血性疾病，因此預(yù)防RhD陰性患者產(chǎn)生抗-D在臨床上尤為重要。通常情況下，RhD陰性血液必須輸注給RhD陰性受血者。一旦RhD陰性婦女孕育了RhD陽性胎兒，必須在孕晚期及生產(chǎn)后72 h內(nèi)注射抗-D免疫球蛋白[1]。但最近有較多報道顯示，輸注RhD陰性血清可引起抗-D異源免疫[2-4]，這些獻(xiàn)血者Rh血型最終被確定為DEL型。DEL是一種很弱的D抗原，不能被常規(guī)血清學(xué)試驗檢測出，必須通過吸收-放散試驗檢出。據(jù)報道亞洲人群中，常規(guī)血清學(xué)試驗確定的RhD陰性人群實際應(yīng)為DEL型[5]。有學(xué)者認(rèn)為，RhD陰性人群必須避免輸注DEL型血液，以預(yù)防抗-D異源免疫或延遲性溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生[6-8]。由于常規(guī)血清學(xué)方法檢出DEL型有一定難度，因此，建立一種分子篩查RHD基因方法十分必要。盡管RHD基因分型能有效區(qū)分DEL型和RhD陰性個體，但其費用昂貴且檢測時間較長。本研究對RhD（–）獻(xiàn)血者進(jìn)行RhD基因定型、弱D檢測和RhCE基因定型，以期尋找一種有效針對無償獻(xiàn)血者的RhD基因分型方法。

材料與方法

1 樣本來源 從南京紅十字血液中心Rh（–）無償獻(xiàn)血者隊伍中隨機(jī)招募30例無償獻(xiàn)血者，留取5 ml靜脈血樣，經(jīng)EDTA-Na2抗凝，1 500g離心10 min分離血漿與血細(xì)胞，用于后續(xù)血清學(xué)檢測和RT-PCR檢測。

2 血清學(xué)檢測 血液樣本RhD抗原檢測根據(jù)AABB標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行?？?D單克隆多克隆混合抗體試劑購于美國奧托臨床診斷公司，抗-D單克隆IgG/IgM試劑購于英國密理博公司。采用間接抗球蛋白實驗（IAT）進(jìn)行RhD分型及弱D抗原分型。血液樣本RhC/c和RhE/e分型使用單克隆抗-C、抗-c、抗-E和抗-e試劑，均購于奧托臨床診斷公司。不規(guī)則抗體檢測采用Coombs試驗。

3 熒光定量PCR檢測 采用熒光定量PCR方法檢測RHD基因啟動子、第4內(nèi)含子、第7和10外顯子。20 μl PCR體系包含：2 μl DNA，10 μl SYBR Green I，2 μl上、下游引物和4 μl H2O。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性15 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s。應(yīng)用ABI 7500熒光定量PCR儀。

結(jié) 果

30例Rh（–）無償獻(xiàn)血者血液樣本的血清學(xué)血型鑒定及RHD基因檢測結(jié)果顯示，21例未檢測到RHD基因，2例為雜交型，其余7例存在RHD啟動子、第4內(nèi)含子和第7、10外顯子，其中5例為DEL型，1例為弱D，1例為部分D。30例無償獻(xiàn)血者的RhCE基因型為，20例C–E–c+e+，6例C+E–c+e–，2例C+E–c+e+，1例C–E+c+e–；C-E–c+e+型血液樣本均未檢測到RHD基因；采用“C–E–c+e+”表型診斷RhD（–）和RHD基因完全缺失的陽性預(yù)測值高達(dá)100%。見表1。

表1 30例無償獻(xiàn)血者RhD表型和基因型檢測情況

討 論

Rh（–）血型在亞洲人群中并不常見，僅占約1%[9]。對于無償獻(xiàn)血工作而言，招募并維持固定稀有血型獻(xiàn)血者十分重要。如何正確鑒定RhD（–）血型更是關(guān)系到臨床輸血安全的重要問題。為避免RhD（–）受血者因輸注含RhD變異體（包括DEL型）血液引起RhD異源免疫，我們對RhD（–）無償獻(xiàn)血者進(jìn)行RhD抗原和基因檢測。

目前，許多學(xué)者都關(guān)注RhD變異體（包括DEL），這些變異體往往不能被常規(guī)血清學(xué)試驗檢出。本研究發(fā)現(xiàn)30例無償獻(xiàn)血者中DEL型、弱D和部分D（各占8.33%、3.33%和3.33%）均被常規(guī)血清學(xué)定型為RhD（–）。有研究顯示DEL血型與C+表型高度一致。其中5例DEL型均顯示為C+表型，因此建議在抗-D吸收/放散試驗后進(jìn)行C+表型定型更有助于DEL血型的檢出。

此外，研究發(fā)現(xiàn)20例C–E–c+e+均為RhD（–），若采用“C–E–c+e+”診斷RhD（–），其陽性預(yù)測值可達(dá)100%。然而，也有文獻(xiàn)報道DEL型個例是C–E–c+e+型[10]。在本研究中，基于“C–E–c+e+”表型均為Rh（–）血型，我們提出新觀點，即采用RHCE分型作為Rh（–）定性的篩選檢查，能較好地區(qū)分D變異體，對于正確檢測Rh血型、建立和維護(hù)Rh（–）獻(xiàn)血者隊伍大有裨益。

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Analysis of RhD Phenotype and Genotype in RhD （-）Blood Donors

TAN Wei. Nanjing Red Cross Blood Center，Nanjing210003

Objective To built an effective method for RhD genotyping. Methods RhD phenotyping，weak D testing and RhCE phenotyping were performed in 30 samples from members of the RhD-negative club in Nanjing Red Cross Blood Center. The RhD promoter，intron 4，and exons 7 and 10 were analysed by real-time PCR. Results Of 30 RhD-negative persons，21 showed complete deletion of the RhD gene，2 showed the results consistent with RhD-CE-D hybrid，and 7 showed amplification of RhD promoter，intron 4，and exons 7 and 10. Of the latter group，5 were in the DEL blood group，1 were weak D，1 was partial D. The RhD-negative phenotype samples consisted of 20 C-E-c+e+，6 C+E-c+e-，2 C+E-c+e+ and 1 C-E+c+e-. The C-E-c+e+ phenotype showed 100% positive predictive value for detecting D-negative cases.Conclusion RhCE phenotyping is efficient to distinguish D-variants in RhD（–）screening test.

RhD Genotyping Blood donor

R392.11 R193.2

A

1671-2587（2017）06-0621-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.027

*本課題受南京市衛(wèi)生局課題（No.QYK11150）資助

210003 江蘇省南京紅十字血液中心中心

談維（1964–），男，江蘇南京人，副主任技師，主要從事臨床輸血質(zhì)量控制與管理工作，（E-mail）183530583@qq.com。

2017-07-23）

（本文編輯：王敏）