張霞 朱超望 王瑩超 眭陽 尹娟

碳青霉烯中介腸桿菌科細(xì)菌耐藥性及相關(guān)基因檢測

張霞 朱超望 王瑩超 眭陽 尹娟

目的 分析碳青霉烯類藥物敏感性中介腸桿菌科細(xì)菌（Carbapenem-intermediate Enterobacteriaceae，CIE）的耐藥特性及其攜帶碳青霉烯酶基因情況。方法 收集2015年3月～2017年1月南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)分離的26株CIE，分析菌株對抗菌藥物的敏感性，并通過聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）篩選碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和OXA48基因。結(jié)果 26株臨床分離的CIE菌株中，對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶等藥物耐受均達(dá)到80%以上，PCR法檢測到6株細(xì)菌攜帶碳青霉烯酶基因，包括KPC 4株、NDM 1株、IMP 1株。結(jié)論 碳青霉烯中介腸桿菌科細(xì)菌多重耐藥率較高，且檢出碳青霉烯酶基因的菌株也占一定比例，需進(jìn)一步加強(qiáng)臨床多重耐藥細(xì)菌的監(jiān)測。

腸桿菌科細(xì)菌 多重耐藥 碳青霉烯酶基因

腸桿菌科細(xì)菌為革蘭陰性菌，是臨床常見和易分離的病原菌，常引起患者嚴(yán)重感染和醫(yī)院獲得性感染。β內(nèi)酰胺類抗生素一直是治療嚴(yán)重腸桿菌科細(xì)菌感染最成功的抗生素，隨著抗菌藥的廣泛應(yīng)用尤其是不合理用藥，產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶的細(xì)菌不斷增加，碳青霉烯類抗菌藥被認(rèn)為是治療多重耐藥特別是產(chǎn)ESBLs 酶腸桿菌科細(xì)菌的有力武器，是治療ESBL菌株的最后一道防線。但是近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥的大量使用，臨床出現(xiàn)耐碳青霉烯類

抗菌藥的腸桿菌科細(xì)菌（ Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE），且逐年增加，給臨床治療和院內(nèi)感染控制帶來極大困難[1]，尤其自本世紀(jì)初，出現(xiàn)了產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株而導(dǎo)致對碳青霉烯類藥物耐藥，并蔓延全球。這些CRE菌株感染都伴隨著高發(fā)病率和死亡率，特別是在醫(yī)院環(huán)境中的高?；颊?，成為全世界醫(yī)院獲得性感染中導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要原因[2-4]。目前有較多對耐碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的研究[5-8]，但對于碳青霉烯藥物敏感性為中介的腸桿菌科細(xì)菌的研究極少。為此，本院對CIE臨床分離株進(jìn)行調(diào)查，分析該類細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，并分析其攜帶碳青霉烯基因情況，為臨床細(xì)菌耐藥防控策略制訂提供依據(jù)。

材料與方法

1 材料 2015年3月～2017年1月南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)收集的26株非重復(fù)CIE臨床分離株，其中大腸埃希菌10株、肺炎克雷伯菌8株、沙雷菌屬4株、陰溝腸桿菌3株、產(chǎn)氣腸桿菌1株。

2 儀器與試劑 使用法國生物梅里埃公司ATB Expression 細(xì)菌鑒定儀對菌株進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品。藥敏紙片：亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林、氨芐西林、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、粘菌素及M-H干粉培養(yǎng)基均購自英國Oxoid公司。PCR試劑、DNA Ladder 購自Sigma公司。

3 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby- Bauer 紙片（K-B）瓊脂擴(kuò)散法測定抗菌藥物對菌株抑菌圈的直徑。結(jié)果按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感、中介或耐藥[9]。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

4 碳青霉烯酶基因檢測分析 利用煮沸法提取細(xì)菌DNA。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增碳青霉烯酶基因：KPC、IMP、VIM、NDM和OXA48基因，引物見表1。PCR反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性10 min；然后變性95℃ 30 s，退火時(shí)間30 s，退火溫度分別為52℃、54℃、55℃、56℃，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染色劑使用GoldView1型，紫外燈下觀察結(jié)果，將目的片段大小一致的陽性標(biāo)本PCR產(chǎn)物，送上海生物工程股份有限公司進(jìn)一步測序驗(yàn)證結(jié)果，所測序列與GenBank中BLAST程序中的序列比對。

表1 碳青霉烯酶基因引物

結(jié) 果

1 耐藥情況分析 26株碳青霉烯藥物敏感性為中介的腸桿菌科細(xì)菌大多表現(xiàn)為多重耐藥，其對第三、第四代頭孢菌素等多種β‐內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率較高，對氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟、阿莫西林/克拉維酸的耐受均達(dá)到80%以上，對粘菌素均敏感，見表2。2 碳青霉烯酶基因PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果 26株臨床分離的CIE中，有6株（23.1%）檢測到碳青霉烯酶基因，其中KPC陽性（ 448 bp） 4株（圖1），NDM陽性（292 bp） 1株（圖2），IMP陽性（587 bp） 1株（圖3），PCR產(chǎn)物送上海生物工程股份有限公司進(jìn)一步測序驗(yàn)證，所測序列與GenBank中BLAST程序中的序列比對，證實(shí)PCR陽性結(jié)果均正確。

討 論

目前，細(xì)菌耐藥性已成為全球關(guān)注的問題，耐藥細(xì)菌所致感染己成為臨床抗感染治療的新挑戰(zhàn)，是當(dāng)前人類健康和生命的主要威脅。腸桿菌科細(xì)菌分布廣，與人類關(guān)系密切。在醫(yī)院感染中，腸桿菌科細(xì)菌中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌，并以多重耐藥菌株引起的感染為顯著特點(diǎn)。美國更是將控制耐藥細(xì)菌提升到了國家戰(zhàn)略，提出其核心是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）。對CRE菌株耐藥機(jī)制的研究可解釋細(xì)菌對抗生素耐藥的分子機(jī)制以及耐藥決定子的傳播方式，可作為臨床用藥的參考，有助于減少或延緩耐藥性的發(fā)生、感染控制及新藥開發(fā)等，具有重要的臨床價(jià)值。

腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制主要有以下四個(gè)方面：①產(chǎn)生水解碳青霉烯類抗菌藥的碳青霉烯酶（如KPC，NDM，VIM，IMP和OXA-48）；②外膜蛋白 （ OmpF、OmpC等） 的缺失或數(shù)量減少，伴高產(chǎn)AmpC酶、ESBLs 酶等；③主動外排泵系統(tǒng)的活躍；④藥物作用靶位的改變，主要為青霉素結(jié)合蛋白PBP的改變。在上述幾種耐藥機(jī)制中，產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類耐藥最主要的機(jī)制[10]。碳青霉烯酶的編碼基因定位在質(zhì)粒、整合子等可轉(zhuǎn)移的基因元件上，且腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯耐藥主要由質(zhì)粒介導(dǎo)[11-14]，耐藥基因容易隨質(zhì)粒在不同菌種之間傳播，造成耐藥性的擴(kuò)散。

表2 26株碳青霉烯藥物敏感性為中介的腸桿菌科細(xì)菌對常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)（n，%）

圖1 KPC基因PCR檢測結(jié)果

圖2 NDM基因PCR檢測結(jié)果

圖3 IMP基因PCR檢測結(jié)果

碳青霉烯類抗菌藥作為治療多重耐藥特別是產(chǎn)ESBLs 酶腸桿菌科細(xì)菌的最后一道防線，細(xì)菌對其敏感性降低必需引起臨床重視，包括對碳青霉烯藥物敏感性中介的腸桿菌科細(xì)菌。本研究分析了臨床分離的26株碳青霉烯藥物中介的腸桿菌科細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)大多表現(xiàn)為多重耐藥，其對第三、第四代頭孢菌素等多種β‐內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率較高，對氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟、阿莫西林/克拉維酸的耐受均達(dá)到80%以上。通過PCR檢測這些菌株攜帶碳青霉烯酶基因發(fā)現(xiàn)：KPC陽性4株，NDM陽性1株，IMP陽性1株，共有6株檢測到碳青霉烯酶基因，占全部菌株的23.1%。

綜上，臨床碳青霉烯藥物中介的腸桿菌科細(xì)菌大多表現(xiàn)為多重耐藥，臨床治療該類細(xì)菌感染可根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗菌藥物，并需結(jié)合微生物學(xué)和分子生物學(xué)方法監(jiān)測其在醫(yī)院內(nèi)的傳播情況，以指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。

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Investigate on the Carbapenemases Genes and Drug Resistance in Carbapenem-intermediate Enterobacteriaceae

ZHANG Xia，ZHU Chao-wang，WANG Ying-chao，et al. Department of Clinical Laboratory，The North District of Affiliated Suzhou Hospital，Nanjing Medical University，Suzhou215008

Objective To investigate the drug resistance of Carbapenem-intermediate Enterobacteriaceae（CIE），and whether carrying carbapenemases gene. Methods 26 CIE isolates were collected from March 2015 to January 2017 in the North District of Affiliated Suzhou Hospital，Nanjing Medical University，drug resistance of these isolates were investigated by antibiotic susceptibility testing. Carbapenemase genes KPC，NDM，IMP，VIM and OXA48 were detected by polymerase chain reaction （PCR）. Results More than 80% of 26 CIE clinical isolates were resistance to ampicillin，cefazolin，ceftazidime. PCR detected 6 isolates carrying carbapenemase genes，including 4 isolates of KPC，1 isolate of NDM and 1 isolate was IMP positive. Conclusion The multidrug resistance rate in carbapenems-intermediate Enterobacteriaceae was high，and the carbapenemases gene positive isolates were also account for a certain proportion，which suggests that the clinical monitoring of multiple drug-resistant bacteria needs to be further strengthen.

Enterobacteriaceae Multidrug resistance Carbapenemases gene

R378.2 R392.11

A

1671-2587（2017）06-0614-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.025

215008 蘇州，南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)檢驗(yàn)科

張霞（1975–），女，江蘇南通人，副主任技師，學(xué)士，主要從事臨床檢驗(yàn)工作，（Tel）13962164303（E-mail）616463097@qq.com。

2017-03-17）

（本文編輯：王敏）