楊伊磊，李夢丹，劉 金，陳力力,2,*，蔣立文,2,*

毛霉型豆豉后發(fā)酵階段蛋白質水解產物的生成及影響因素

楊伊磊1，李夢丹1，劉 金1，陳力力1,2,*，蔣立文1,2,*

（1.湖南農業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、反相高效液相色譜等方法對毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中蛋白質及其水解產物的變化情況進行研究，對各階段蛋白質水解產物與不同因素指標的相關性進行分析，并采用API ZYM系統(tǒng)對毛霉所產胞外酶進行半定量檢測。結果表明：蛋白質最終水解產物的分子質量主要集中在11～20 kD之間，后發(fā)酵0～7 d蛋白質分子質量下降迅速，且此階段多肽成分發(fā)生較大改變，7～42 d主要引起的是多肽含量的變化；總酸含量與蛋白質水解物生成的相關性最高，相關系數為0.972，其次為褐變強度，再次為還原糖含量；API ZYM系統(tǒng)檢測出毛霉可產生6 種胞外酶。

毛霉型豆豉；蛋白質；水解產物；API ZYM系統(tǒng)

毛霉型豆豉是利用毛霉進行純種發(fā)酵的我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，發(fā)酵分為制曲和后發(fā)酵兩個階段。在制曲階段，毛霉大量生長繁殖，產生孢子，并分泌蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶系；后發(fā)酵階段主要是依靠制曲過程中毛霉分泌產生的大量酶系在厭氧的條件下，通過食鹽、白酒等作用進行復雜的生物化學反應，從而形成毛霉型豆豉特殊的風味[1-5]。目前國內外對毛霉型豆豉后發(fā)酵過程的工藝條件優(yōu)化、理化指標的變化、微生態(tài)群落的動態(tài)變化已經有了部分的研究[6-10]，但對后發(fā)酵過程中蛋白質水解產物的研究尚少，且不夠深入。

蛋白質是生命的物質基礎，人及動物從食品中獲取蛋白質及其分解產物來構成自身的蛋白質，毛霉型豆豉作為一種大豆發(fā)酵制品，是優(yōu)質蛋白的良好來源[11]。發(fā)酵豆制品在加工的過程中，蛋白質降解為大豆多肽及游離氨基酸，更加有利于人體的吸收利用。因此，深入研究毛霉型豆豉蛋白質及其水解產物的變化是有必要的。

本實驗通過測定毛霉型豆豉后發(fā)酵不同階段蛋白質及其水解產物的變化，并對該動態(tài)過程中不同的因素指標與蛋白質水解產物的相關性進行研究，分析影響蛋白質水解產物發(fā)生變化的因素，為評價豆豉品質、控制蛋白水解產物的生成以及豆豉蛋白源功能性食品的開發(fā)等提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆購自湖南農業(yè)大學東之源超市；毛霉CGMCC8700由湖南農業(yè)大學食品科學和生物技術湖南省重點實驗室提供。

黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基：8%黃豆粉、2%瓊脂。

蛋白質Marker 天根生化科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘油、Tris、過硫酸銨、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；乙腈、溴酚藍、β-巰基乙醇、丙烯酰胺儲存液、甘氨酸、考馬斯亮藍R-250、茚三酮、3,5-二硝基水楊酸 國藥集團化學試劑公司；API ZYM試劑盒 法國梅里埃公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；DYCZ-28A型垂直電泳儀、DYY-8C型電泳儀電源 北京市六一儀器廠；HSJ通風柜 深圳市嘉鴻順實業(yè)有限公司；HC-1016高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TP-100D電子天平 湘儀天平儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毛霉型豆豉的制作工藝流程

根據參考文獻[11-12]制作毛霉型豆豉，其工藝流程如下所示：

黃豆→25 ℃浸泡12～16 h→121 ℃高壓滅菌鍋蒸煮20 min→攤涼接種毛霉1%→15 ℃前發(fā)酵64 h→加入9%的食鹽、5%的白酒→入罐45 ℃后發(fā)酵→成品

每隔7 d取后發(fā)酵階段的豆豉作為樣品，直至42 d結束，樣品冷凍真空干燥后備用。

1.3.2 蛋白質及水解產物含量測定

參照GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中分光光度法測定蛋白質含量[11]；采用甲醛滴定法[11]測定氨基酸態(tài)氮含量；采用茚三酮比色法[13]測定游離氨基酸總量。

1.3.3 蛋白質水解產物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照文獻[14-16]中的TCA-丙酮沉淀法提取豆豉樣品中的蛋白質，并干燥。取上述干燥樣品40 mg，加入400 μL ddH2O，600 μL 5×樣品緩沖液超聲波振蕩20 min，靜置1 h后沸水浴5 min，于10 000 r/min離心10 min，上清液即樣液。采用SDS-PAGE垂直板電泳不連續(xù)系統(tǒng)，條件為：5%濃縮膠，12%分離膠，上樣體積20 μL，先恒壓130 V電泳至樣品進入分離膠，然后恒壓160 V。電泳結束后，經考馬斯亮藍R-250染色20 min后脫色，拍照記錄結果。

1.3.4 蛋白質水解物的反相高效液相色譜分析[17]

準確稱量0.500 g純種發(fā)酵豆豉粉末，加入10 mL ddH2O，超聲波提取1.5 h，然后在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液過0.45 μm水系濾頭，于10 mL潔凈試管中備用，此時樣品溶液質量濃度為50 μg/μL。采用反相高效液相色譜分析，條件為：色譜柱Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）=45∶55；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.5 豆豉后發(fā)酵過程指標測定

參照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》測定后發(fā)酵過程中水分含量[7]；采用酸度計法[7]測定總酸含量；采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid spectrophotometry，DNS）比色法[7]測定還原糖含量；采用分光光度法[7]測定褐變強度。

1.3.6 API ZYM半定量測定酶活性

刮取黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基上生長茂盛、產生大量孢子的毛霉菌絲5 g，加入10 mL無菌生理鹽水，常溫條件下超聲波處理1 h，過濾取濾液作為樣液，在API ZYM試紙條的每孔中加入65 μL樣液，放置10 min，然后每孔分別加1 滴ZYM A試劑（Tris緩沖液）和ZYM B試劑（堅牢蘭B），然后暴露在強光下5 min，根據顯色結果與標準半定量色板比較，記錄結果。

1.4 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，并用Duncan’s法對各測定數據進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 后發(fā)酵過程中蛋白質及水解產物的變化

表1 豆豉后發(fā)酵過程中蛋白質及其水解產物的變化Table 1 Changes in protein, amino acid nitrogen and free amino acid contents during the post-fermentation of douchi

對毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中的蛋白質及其水解產物進行測定，結果如表1所示。氨基酸態(tài)氮含量可以反映出蛋白質的水解程度[18]，豆豉在發(fā)酵過程中，蛋白質在蛋白酶、肽酶的協(xié)同作用下水解為水溶性低分子的含氮化合物，最終水解為游離氨基酸。因此氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的含量可以反映出蛋白質水解產物的變化情況。由表1可知，在后發(fā)酵過程中，毛霉型豆豉總蛋白的整體變化趨勢是很小的，各階段均無顯著性，說明豆豉在后發(fā)酵過程中總氮含量維持著一種動態(tài)的平衡，非蛋白氮與蛋白氮之間進行了相互轉化。氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的質量分數隨著發(fā)酵時間的延長而增加，且0 d與7 d差異性顯著，分別升高了156%和49%。這說明隨著發(fā)酵過程的進行，大量的蛋白質被水解，在后發(fā)酵0～7 d階段，由于前期制曲積累的蛋白酶、水解酶等的協(xié)同作用，水解了肽鏈之間的肽鍵，蛋白質被迅速分解為小分子蛋白和多肽，進而使游離的氨基酸釋放出來[19]。而隨著發(fā)酵的進一步進行，酶活力減弱，再加上部分游離氨基酸參與了美拉德反應，使得氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的含量增加幅度減弱，趨于平緩。

2.2 后發(fā)酵過程中蛋白質水解物分子質量的變化

圖1 豆豉后發(fā)酵不同階段蛋白質分子質量的變化Fig. 1 Changes detected by SDS-PAGE in protein molecular weight during the post-fermentation of douchi

蛋白質水解作用貫穿了毛霉型豆豉發(fā)酵的全過程，選取后發(fā)酵不同階段的樣品進行電泳分析，由圖1可知，隨著后發(fā)酵過程的進行，分子質量在20 kD以上的蛋白質幾乎已經完全水解，且發(fā)酵過程中蛋白質水解的最終產物的分子質量主要集中在11～20 kD之間。在后發(fā)酵0d時，分子質量35 kD附近出現的明顯條帶在發(fā)酵7 d后明顯變淡，說明在后發(fā)酵開始階段，由于前發(fā)酵階段積累的蛋白酶的作用，大分子蛋白質被迅速降解，生成小分子蛋白、多肽和氨基酸，發(fā)酵7 d之后蛋白質降解速率明顯變慢，這是因為隨著發(fā)酵過程的進一步進行，毛霉生長過程中分泌的淀粉酶、脂肪酶使得大豆中的碳水化合物和脂肪分解成有機酸和脂肪酸，總酸含量快速增加，蛋白酶活力變弱，再加上白酒和食鹽的添加，且隔絕了氧氣，使得毛霉的生長受到抑制，蛋白酶活力大大降低。從圖1可以看出，分子質量在11～20 kD區(qū)域條帶并不清晰，但有明顯的陰影區(qū)，這是因為在此區(qū)域的小分子蛋白質含量較多，而各種小分子蛋白質的分子質量又相近，這使得條帶間并不易清晰辨別，從而形成了陰影區(qū)。

2.3 后發(fā)酵過程中蛋白質水解物多肽的變化

圖2 豆豉后發(fā)酵不同階段蛋白質水解物的變化Fig. 2 Changes analyzed by RP-LC in protein hydrolysates during the post-fermentation of douchi

為分析豆豉后發(fā)酵過程中多肽的變化情況，采用反相高效液相色譜法對后發(fā)酵不同階段樣品的蛋白水解物進行測定分析[20-21]，從圖2可以看出，后發(fā)酵0～7 d，出峰情況出現明顯改變，保留時間提前，多肽成分有著明顯變化，后發(fā)酵開始階段（0 d）時，樣品在保留時間至15 min開始出峰，其中有5 個峰的峰高較高，峰面積較大，說明此5 種多肽類化合物含量較多，在保留時間為41.66～43.715 min之間出的4個峰未完全分離開，可能是此4 種多肽組分的極性相似度較大造成的。后發(fā)酵至7 d時，出峰時間主要在3.715～5.378 min，且在保留時間為15.768 min時也出了一個峰，0～7 d階段多肽的變化情況是由于前發(fā)酵階段積累的蛋白酶等酶系的作用，大分子蛋白質迅速降解，多肽類種類發(fā)生了明顯的變化。而在后發(fā)酵7～42 d階段，多肽的種類幾乎沒有改變，而肽類化合物的含量出現變化，大部分多肽成分含量都有所增加，如在保留時間4.780 min出現的峰隨著后發(fā)酵過程的進行，峰高明顯增高，且峰面積增大，這說明7～42 d階段大多是物質代謝引起的多肽含量的變化。

2.4 豆豉后發(fā)酵過程中的理化成分分析

表2 毛霉型豆豉后發(fā)酵不同階段基本成分的變化Table 2 Changes in chemical components and browning intensity during the post-fermentation of Mucor- type douchi

由表2可知，在后發(fā)酵過程中，水分質量分數基本保持在55%左右，說明在后發(fā)酵過程中水分的變化是很小的；還原糖含量隨著后發(fā)酵過程的進行逐漸增加，這是因為前發(fā)酵過程毛霉所分泌的糖化酶累積，分解成了大量的還原糖，而隨著發(fā)酵時間的進一步延長，微生物分泌的糖化酶活力降低，且部分還原糖又參與美拉德反應，使得還原糖含量又有略微降低的趨勢；總酸含量先迅速增加，隨后趨于穩(wěn)定，這是由于在后發(fā)酵的初始階段，毛霉在前發(fā)酵生長過程中積累的淀粉酶、脂肪酶使得大豆中的碳水化合物和脂肪分解成有機酸和脂肪酸，從而使總酸含量快速增加，而隨著發(fā)酵時間的延長，食鹽和白酒的添加使得微生物生長受到抑制，酶活力大大降低，同時部分酸與醇類合成酯類使得酸度增長較慢甚至不再增加，這使得總酸的含量不再增加，而趨于穩(wěn)定。豆豉的褐變主要集中在成熟階段，隨著后發(fā)酵時間的延長，褐變的程度越大，顏色越深，目前褐變的原因被認為有兩種，一種是由于美拉德反應而引起，另一種認為是酶系褐變導致[22]。

2.5 不同因素與蛋白質水解產物生成的相關性

以毛霉型豆豉后發(fā)酵不同階段蛋白質的水解產物（游離氨基酸總量指標）為縱坐標（y），再分別以水分、總酸、還原糖質量分數和褐變強度指標為橫坐標（x）作散點圖，如圖3所示，再利用SPSS 17.0數據統(tǒng)計軟件進行兩個變量之間的相關性分析，并進行線性回歸。利用Pearson相關系數對各指標與蛋白質水解產物的相關性進行評價，并利用雙尾檢驗法評價顯著水平，得到蛋白質水解物與各因素指標的相關性方程，結果如表3所示。

圖3 各因素指標與蛋白質水解物的關系Fig. 3 Relationships between various chemical components as well as browning intensity and free amino acid content

表3 各因素指標與蛋白質水解物的相關性Table 3 Correlations between various chemical components as well as browning intensity and free amino acid content

由圖3和表3可知，在毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中，水分含量與蛋白質水解物變化不具有相關性，總酸含量與蛋白質水解物具有極顯著相關性，相關系數為0.972；還原糖含量、褐變強度與蛋白質水解物具有顯著相關性，相關系數分別為0.834和0.863。說明總酸含量、還原糖含量、褐變強度指標都影響了蛋白質水解產物的生成，在一定范圍內呈現正相關性，且總酸含量＞褐變強度＞還原糖含量。

2.6 API ZYM半定量測定毛霉所產胞外酶

由上述結果可知，毛霉型豆豉在后發(fā)酵過程的初始階段（0～7 d）蛋白質水解產物快速生成，變化顯著，分析其與毛霉菌種所產酶系密切相關，故采用API ZYM系統(tǒng)對毛霉菌種所產胞外酶進行半定量檢測，結果如圖4所示。

圖4 API-ZYM系統(tǒng)測定結果Fig. 4 Detection of extracellular enzymes from Mucor by API-ZYM system

API ZYM系統(tǒng)可快速地對4 種酯酶、5 種蛋白（多肽）酶、2 種水解酶8 種糖發(fā)酵酶等19 種酶活性作出半定量分析[23-25]，由圖3可知，毛霉可分泌6 種胞外酶，包括2 種酯酶（堿性磷酸鹽、酯酶C4），1 種蛋白酶（白氨酸芳胺酶），2 種水解酶（酸性磷酸鹽、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶），1 種糖發(fā)酵酶（N-乙酰葡萄糖胺酶）。其中白氨酸芳胺酶可水解某些氨基酸與芳香胺所形成的酰胺類化合物，能反映亮氨酸氨基肽酶的活力，而亮氨酸氨肽酶能從多肽鏈上游離的氨基末端（N端）由外向里逐個地把氨基酸切下，解除小肽的苦味[26-28]，故毛霉所產的白氨酸芳胺酶為水解多肽，釋放出游離氨基酸的主要蛋白酶；N-乙酰葡萄糖胺酶亦稱幾丁二糖酶，作用部位是底物寡糖鏈的非還原性末端，能降解幾丁二塘，生成幾丁質單糖——N-乙酰葡萄糖胺[29]，由于N-乙酰葡萄糖胺酶的作用，會使得后發(fā)酵過程中還原糖含量增加，從而與游離氨基酸參與美拉德反應。堿性磷酸酶是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等；酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解成為無機磷酸的水解酶[30]。酯酶是一種水解酶，優(yōu)先水解短鏈脂肪酸，可在水分子的參與下，經由水解作用，將酯類切割成酸類與醇類。磷酸酶和酯酶均對蛋白質的水解起著間接作用。

3 結 論

毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中，蛋白質快速水解的階段要集中在后發(fā)酵初始階段（0～7 d），蛋白質水解最終產物的分子質量主要集中在11～20 kD之間，0～7 d階段蛋白質大分子迅速降解成小分子，且多肽成分發(fā)生較大改變，而7～42 d階段主要引起多肽含量的變化；蛋白質水解物與不同因素指標的相關性研究表明，總酸、褐變程度、還原糖會影響蛋白質水解物的生成；通過API ZYM半定量檢測系統(tǒng)檢測出毛霉菌種在黃豆粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)積累下來的胞外酶有6 種。

[1] 范琳. 毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中微生態(tài)的變化及抗氧化性研究[D].長沙∶ 湖南農業(yè)大學, 2013.

[2] LI F J, YIN L J, LU X, et al. Changes in angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory activities during the ripening of douchi (a Chinese traditional soybean product) fermented by various starter cultures[J].International Journal of Food Properties, 2010, 13(3)∶ 512-524.DOI:10.1080/10942910802688176.

[3] LU H, ZHANG B B, WU Z H. Studies on Mucor racemosus fermentation to manufacture gamma-linolenic acid functional food douchi[J]. Food Science and Technology Research, 2010, 16(6)∶ 534-548. DOI:10.3136/fstr.16.543.

[4] FAN J, HU X, TAN S, et al. Isolation and characterisation of a novel angiotensin Ⅰ-converting enzyme-inhibitory peptide derived from douchi,a traditional Chinese fermented soybean food[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(4)∶ 603-608. DOI:10.1002/jsfa.3482.

[5] CHEN K I, ERH M H, SU N W, et al. Soyfoods and soybean products∶from traditional use to modern applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(1)∶ 9-22. DOI:10.1007/s00253-012-4330-7.

[6] 索化夷, 趙欣, 騫宇, 等. 永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中微生物總量與區(qū)系變化規(guī)律[J]. 食品科學, 2015, 36(19)∶ 124-131. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201519022.

[7] 陳丹丹. 毛霉發(fā)酵豆制品在不同后發(fā)酵工藝條件下品質分析[D]. 南昌∶ 江西農業(yè)大學, 2012.

[8] 吳蘭芳, 蔣愛民, 曲直, 等. 霉菌型黑豆豆豉的主要成分及其抗氧化活性研究[J]. 現代食品科技, 2013, 29(1)∶ 51-54. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2013.01.038.

[9] 胡會萍, 李秀娟, 黃賢剛. 傳統(tǒng)豆豉微生物學研究綜述[J]. 中國調味品, 2012(6)∶ 4-7; 13. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2012.06.002.

[10] WANG L, YIN L, LI D, et al. Influences of processing and NaCl supplementation on isoflavone contents and composition during douchi manufacturing[J]. Food Chemistry, 2007, 101(3)∶ 1247-1253.DOI:10.1016/j.foodchem.2006.03.029.

[11] 房翠蘭. 豆豉加工過程中蛋白質和膳食纖維生物學變化的研究[D].重慶∶ 西南大學, 2007.

[12] 楊勇, 詹永, 李征, 等. 快速發(fā)酵豆豉關鍵技術及問題討論[J]. 現代食品科技, 2008(8)∶ 87-89. DOI:10.3969/j.issn.1673-9078.2008.08.022.

[13] 張雨浩. 黑色素快速產生階段豆豉蛋白水解物參與黑色素形成機制研究[D]. 重慶∶ 西南大學, 2014.

[14] 索化夷, 騫宇, 闞建全. 傳統(tǒng)發(fā)酵永川毛霉型豆豉蛋白質提取方法比較與降解規(guī)律研究[J]. 食品科學, 2013, 34(23)∶ 180-183.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201323038.

[15] 管方方, 盧偉京, 許旭, 等. 大豆特征蛋白的SDS-PAGE研究[J]. 精細化工, 2015, 32(4)∶ 16. DOI:10.13550/j.jxhg.2015.04.016.

[16] SARAVANAN R S, ROSE J K C. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J]. Proteomics, 2004, 4(9)∶ 2522-2532. DOI:10.1002/pmic.200300789.

[17] ZHANG Y H, MA L, WANG X. Correlation between protein hydrolysates and color during fermentation of Mucor-type douchi[J].International Journal of Food Properties, 2015, 18(12)∶ 2800-2812.DOI∶10.1080/10942912.2015.1013632.

[18] SHAPIRO A L, VI?UELA E, MAIZEL J V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1967, 28(5)∶ 815-820. DOI:10.1016/0006-291X(67)90391-9.

[19] 索化夷, 盧露, 吳佳敏, 等. 永川豆豉在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中基本成分及蛋白酶活性變化[J]. 食品科學, 2011, 32(1)∶ 177-180.

[20] 韓佳冬. 永川豆豉蛋白水解產物與黑色素形成機理的研究[D]. 重慶∶ 西南大學, 2013.

[21] 張雨浩, 馬良, 周夢柔, 等. 永川豆豉發(fā)酵過程中蛋白水解作用與黑色素形成關系[J]. 食品科學, 2013, 34(19)∶ 195-199. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201319041.

[22] 孫森. 天然發(fā)酵豆豉后發(fā)酵過程的動態(tài)分析[D]. 濟南∶ 山東輕工業(yè)學院, 2008.

[23] 董青生, 何雅麗, 陳宇. API-ZYM系統(tǒng)在部分真菌胞外酶種類分析中的應用[J]. 中國皮膚性病學雜志, 2011(9)∶ 727-728.

[24] KILCAWLEY K N, WILKINSON M G, FOX P F. Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31(3)∶ 310-320. DOI∶10.1016/S0141-0229(02)00136-9.

[25] BALDRIAN P, VO?í?KOVá J, DOBIá?OVá P, et al. Production of extracellular enzymes and degradation of biopolymers by saprotrophic microfungi from the upper layers of forest soil[J]. Plant and Soil, 2011,338(1/2)∶ 111-125. DOI∶10.1007/s11104-010-0324-3.

[26] 潘進權. 毛霉亮氨酸氨肽酶的純化及性質研究[J]. 食品科學, 2012,33(7)∶ 163-167.

[27] LI L, YANG Z Y, YANG X Q, et al. Debittering effect of Actino Mucor elegans peptidases on soybean protein hydrolysates[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2008, 35(1)∶ 41-47.DOI∶10.1007/s10295-007-0264-y.

[28] 付靜. A. elegans、A. oryzae和R. oligosporus肽酶系統(tǒng)及其脫苦機理的比較研究[D]. 廣州∶ 華南理工大學, 2011.

[29] 王揚, 婁永江, 楊文鴿. 酶法制備幾丁寡糖和殼寡糖研究現狀與進展[J]. 東海海洋, 2001(4)∶ 40-45. DOI∶10.3969/j.issn.1001-909X.2001.04.007.

[30] 劉淵, 李喜煥, 孫星, 等. 磷脅迫下大豆酸性磷酸酶活性變化及磷效率基因型差異分析[J]. 植物遺傳資源學報, 2012(4)∶ 521-528.DOI∶10.3969/j.issn.1672-1810.2012.04.003.

Formation of Protein Hydrolysate and Its Influencing Factors during the Post-Fermentation of Mucor-Type Douchi,a Chinese Traditional Fermented Soybean Product

YANG Yilei1, LI Mengdan1, LIU Jin1, CHEN Lili1,2,*, JIANG Liwen1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

This study analyzed the change of protein and its hydrolysate during the post-fermentation of Mucor-type douchi by SDS-PAGE and reversed-phase liquid chromatography (RP-LC). The correlation of free amino acid content with different chemical components and browning intensity was analyzed, and the extracellular enzymes from Mucor were semi-quantitatively detected by the API ZYM system. The results showed that the molecular weight of the final protein hydrolysate was mainly distributed in the range of 11–20 kD. The molecular weight of proteins was reduced rapidly at the early stage (from day 0 to 7), and the polypeptide composition changed greatly. The polypeptide content changed from day 7 to 42. The formation of free amino acids had the highest correlation with the total acid content with a correlation coefficient of 0.972, followed sequentially by the browning intensity and reducing sugar. Using the API ZYM system we detected 6 extracellular enzymes from Mucor.

Mucor-type douchi; protein; hydrolysate; API ZYM system

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724006

TS264

A

1002-6630（2017）24-0034-06

楊伊磊, 李夢丹, 劉金, 等. 毛霉型豆豉后發(fā)酵階段蛋白質水解產物的生成及影響因素[J]. 食品科學, 2017, 38(24)∶34-39. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724006. http∶//www.spkx.net.cn

YANG Yilei, LI Mengdan, LIU Jin, et al. Formation of protein hydrolysate and its influencing factors during the postfermentation of Mucor-type douchi, a Chinese traditional fermented soybean product[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 34-39.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724006. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-15

國家自然科學基金面上項目（31371828）

楊伊磊（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：357705175@qq.com

*通信作者：陳力力（1962—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：chenlili001281@sina.com

蔣立文（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：1024305380@qq.com