陳 俊 ，葉錦霞 ，林 潔 ，付長(zhǎng)龍 ，劉獻(xiàn)祥 ，吳廣文

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

烏頭湯對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影響

陳 俊1，葉錦霞2，林 潔2，付長(zhǎng)龍2，劉獻(xiàn)祥2，吳廣文2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

目的 通過(guò)觀察烏頭湯對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3的影響，探討其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字法將60只SD大鼠分為空白組15只和造模組45只。造模組在第1、4、7天采用4%木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型。成功造模后，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和治療組各15只?？瞻捉M和模型組灌服0.9%生理鹽水；對(duì)照組灌服雙氯芬酸鈉緩釋膠囊；治療組灌服烏頭湯。2周為1個(gè)療程，療程期間休息2 d，共干預(yù)4個(gè)療程。觀察4組大鼠一般情況、關(guān)節(jié)液情況及血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3濃度變化。 結(jié)果 與空白組比較， 模型組血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3濃度明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，對(duì)照組與治療組血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3濃度均明顯降低（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，治療組血清和關(guān)節(jié)液中IL-6濃度明顯升高（P＜0.05）。 結(jié)論 烏頭湯通過(guò)降低血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量，抑制炎癥反應(yīng)，降低細(xì)胞外基質(zhì)降解，減緩軟骨退變，從而起到治療KOA的目的。

膝骨關(guān)節(jié)炎；IL-1β；IL-6；TNF-α；MMP-3；烏頭湯

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）屬中醫(yī)“痹癥”范疇，是中老年人常見病，以關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙為主要特征的慢性退行性疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子與KOA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2-6］。中醫(yī)藥防治KOA有一定優(yōu)勢(shì)［7-8］，但其作用機(jī)制不明。烏頭湯出自東漢·張仲景《金匱要略》，長(zhǎng)期應(yīng)用于風(fēng)寒濕痹型KOA的臨床治療，療效可靠。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察烏頭湯對(duì)KOA大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影響，探討烏頭湯治療KOA的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只清潔級(jí)2月齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 烏頭湯藥物組成：川烏6 g，麻黃9 g，黃芪 9 g，芍藥 9 g，甘草 9 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥劑科提供。雙氯芬酸鈉緩釋膠囊（中國(guó)藥科大學(xué)制藥有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-3酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó)R&D systems公司）；水合氯醛粉末（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；H-1微型混合器（上海康禾光電儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 烏頭湯藥液的制備 先將制川烏浸泡30 min后水煎煮 1 h，再加入剩余中藥煎煮1 h，過(guò)濾取藥液。將藥液水浴濃縮至含生藥量為4.2 g／mL，冷卻后置于 4℃冰箱保存，備用。

2.2 動(dòng)物分組與造模 SD大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（15只）和造模組（45只）。造模組SD大鼠于第1、4、7天采用膝關(guān)節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型［9］。術(shù)后2周，將造模組隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、治療組各15只。

2.3 藥物干預(yù) 空白組和模型組按照3 mL／（kg·d）予0.9%生理鹽水灌胃。動(dòng)物給藥劑量換算參考文獻(xiàn)［10］，對(duì)照組給予雙氯芬酸鈉緩釋膠囊（1 mg／mL），灌胃量根據(jù)大鼠每周體質(zhì)量按照10 mL／（kg·d）計(jì)算；治療組給予烏頭湯（4.2 g／mL），灌胃量根據(jù)大鼠每周體質(zhì)量按照 10 mL／（kg·d）計(jì)算。2周為1個(gè)療程，共干預(yù)4個(gè)療程，療程期間休息2 d（給藥期間，每周稱1次體質(zhì)量以調(diào)整給藥劑量）。

2.4 取材 干預(yù)4個(gè)療程后，予10%水合氯醛麻醉，膝關(guān)節(jié)備皮，逐層分離至關(guān)節(jié)囊，反復(fù)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)，將關(guān)節(jié)液擠壓至髕上囊內(nèi)側(cè)，于其髕韌帶附著點(diǎn)外上方，用1 mL醫(yī)用注射器穿刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注入0.9% 氯化鈉注射液0.5 mL，抽取關(guān)節(jié)液，置入EP管中，－20℃保存，待檢測(cè)。抽取關(guān)節(jié)液后，常規(guī)腹主動(dòng)脈采血，3 000 rpm離心15 min，吸取上層血清，－20℃保存，待檢測(cè)。

2.5 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3濃度檢測(cè) 用ELISA法檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3的濃度。具體如下：空白孔加樣品稀釋液100μL，余孔加待測(cè)樣品 100μL，酶標(biāo)板覆膜，37℃反應(yīng)120 min。每孔加生物素標(biāo)記抗原工作液100μL，37℃反應(yīng)60 min。洗板3次。每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μL，37℃反應(yīng)60 min。棄去孔內(nèi)液體，洗板3次。依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色。依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。在加終止液后15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的4-Parameter回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況 ① 空白組大鼠皮毛光亮，喜活動(dòng)，反應(yīng)良好，飲食正常；② 模型組大鼠皮毛暗淡，膝關(guān)節(jié)腫脹明顯，患肢拒碰、不愿活動(dòng)，被動(dòng)活動(dòng)時(shí)出現(xiàn)跛行或患肢拖行，懶食；③ 治療組與對(duì)照組大鼠干預(yù)后膝關(guān)節(jié)腫脹程度均減輕，主動(dòng)活動(dòng)時(shí)間增加，反應(yīng)靈敏，食量增加，2組比較無(wú)明顯差別。

3.2 關(guān)節(jié)液變化 空白組大鼠關(guān)節(jié)液無(wú)色、透明清亮、黏稠狀；模型組大鼠關(guān)節(jié)液呈淡黃、半透明，濃稠偶見白色絮狀物，量增多；治療組和對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)液呈淡黃、透明，無(wú)絮狀物，量正常。

3.3 4組血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3濃度比較 見表1。

表1 4 組血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 濃度比較（x±s）pg／mL

3.4 4組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α和 MMP-3濃 度比較 見表 2。

表2 4 組關(guān)節(jié)液 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 濃度比較（x±s）pg／mL

4 討 論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子與膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程密切相關(guān)［11-12］。MMPs是一類廣泛存在于全身結(jié)締組織中的一種蛋白酶，在膝骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中，滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌過(guò)量MMPs，打破MMPs及其抑制劑TIMPs的平衡，使MMPs相對(duì)增多。而MMPs能直接切斷軟骨的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，導(dǎo)致膠原網(wǎng)受到破壞，細(xì)胞外基質(zhì)成分游離出軟骨，使軟骨受損并失去彈性，原本被關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)包埋的軟骨細(xì)胞在力學(xué)和炎性因子的作用下發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致軟骨破壞［13］。MMP-3又名間充質(zhì)降解素，作為MMPs家族中的重要酶類，MMP-3主要通過(guò)參與間質(zhì)膠原酶的激活來(lái)降解Ⅱ型膠原，并能激活其他蛋白酶原，加速軟骨的破壞進(jìn)程。研究表明骨關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中MMP-3含量較健康人增高，其表達(dá)水平與軟骨破壞程度相一致［14］。IL-1β可誘使軟骨細(xì)胞內(nèi)線粒體功能紊亂，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而通過(guò)死亡受體途徑刺激軟骨細(xì)胞死亡區(qū)域蛋白mRNA的表達(dá)，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，從而破壞軟骨層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致 OA 的發(fā)生與發(fā)展［15］；IL-1β 還可通過(guò)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)層中MMPs的表達(dá)，進(jìn)一步破壞軟骨結(jié)構(gòu)［16-18］。TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑，在OA發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。TNF-α作用機(jī)制與IL-1β類似，兩者具有協(xié)同作用［19-21］。IL-6是一種在Ⅱ-1、TNF-α等誘導(dǎo)下由巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有激活 B細(xì)胞和 T細(xì)胞等多種生物學(xué)活性。此外，IL-6可增加滑膜組織炎癥細(xì)胞，刺激軟骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)放大 IL-1β增加 MMP的合成作用和抑制蛋白多糖產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，加速軟骨破壞進(jìn)程［22-23］。

烏頭湯出自《金匱要略》：“病歷節(jié)不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之。烏頭湯方：治腳氣疼痛，不可屈伸?！敝髦魏疂癖宰瑁?yáng)氣不通所致的寒濕歷節(jié)。方中制川烏為君藥，有溫經(jīng)散寒止痛的作用；麻黃為臣藥，能祛風(fēng)發(fā)汗通陽(yáng)行痹；芍藥緩急止痛，使陰陽(yáng)宣通，氣血暢行，利關(guān)節(jié)屈伸；黃芪益氣固衛(wèi)，助溫經(jīng)止痛時(shí)，又可防麻黃過(guò)于發(fā)散，有扶正祛邪之效，兩藥共用為佐藥；炙甘草為使，合益氣減毒之功。諸藥合用，共奏溫經(jīng)散寒，祛濕止痛之效，能針對(duì)KOA痹癥的病因病機(jī)起治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3水平均明顯升高，而經(jīng)過(guò)烏頭湯治療后，IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 水平均明顯降低，提示烏頭湯治療KOA的作用機(jī)制可能是通過(guò)降低血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量，抑制炎癥反應(yīng)，降低細(xì)胞外基質(zhì)降解，減緩軟骨退變，從而起到治療KOA的目的。

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R285.5

A

1000-338X（2017）05-0027-03

2017-05-02

福建省衛(wèi)生計(jì)生青年科研課題（2017－2－46）；陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金（CKJ2016010）

陳俊（1986—），女，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治骨關(guān)節(jié)炎研究。

吳廣文（1982—），男，醫(yī)學(xué)博士，副研究員。E-mail：wuguangwenfj@163.com