張珂勝　陳凌波　黃小平　鄧常清

[摘要]研究黃芪和當(dāng)歸配伍對(duì)小鼠造血干細(xì)胞衰老模型細(xì)胞增殖能力的影響及其作用機(jī)制。大鼠灌胃給藥制備含藥血漿后，體外培養(yǎng)小鼠造血干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、模型組、空白血漿組、芪歸1∶1血漿組、芪歸10∶1血漿組、單用當(dāng)歸血漿組、單用黃芪血漿組，以三丁基過氧化氫（tBHP）誘導(dǎo)小鼠造血干細(xì)胞衰老，以含藥血漿作用于造血干細(xì)胞衰老模型。SAβ半乳糖苷酶染色法檢測細(xì)胞衰老率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，RTPCR檢測Cyclin D1，P21，P53 mRNA表達(dá)，Western blot檢測Cyclin D1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，tBHP作用于造血干細(xì)胞后，可使衰老細(xì)胞增加，細(xì)胞增殖能力降低，G0/G1期細(xì)胞增多，G2/M+S期細(xì)胞減少，同時(shí)伴Cyclin D1表達(dá)降低，P53，P21表達(dá)增強(qiáng)。黃芪、當(dāng)歸、芪歸1∶1配伍、芪歸10∶1配伍含藥血漿可降低衰老細(xì)胞陽性率，使G0/G1期細(xì)胞減少，G2/M+S期細(xì)胞增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，并使Cyclin D1基因和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，P53，P21基因表達(dá)降低。以上效應(yīng)以芪歸1∶1配伍的作用為強(qiáng)。結(jié)果表明，tBHP可使造血干細(xì)胞衰老，細(xì)胞增殖能力降低。黃芪、當(dāng)歸及其配伍可抑制造血干細(xì)胞衰老，促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，以芪歸1∶1配伍的作用為強(qiáng)。其作用機(jī)制可能與其上調(diào)細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)因子表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]造血干細(xì)胞； 衰老； 細(xì)胞增殖； 黃芪； 當(dāng)歸； 細(xì)胞周期

[Abstract]The aim is to study the effect and its mechanism of Astragalus Radix combined with Angelicae Sinensis Radix on the proliferation of hematopoietic stem cells（HSCs） in senescence model After drugcontaining plasma of rats was prepared via intragastric administration， HSCs of mice were cultured in vitro， and then they were divided into blank control group， model group， blank plasma group， Astragalus Radix + Angelicae Sinensis Radix 1∶1 group and 10∶1 group， Angelicae Sinensis Radix plasma group， and Astragalus Radix plasma group HSCs senescence model was induced by using tertbutyl hydrogen peroxide（tBHP）， and intervened by drugcontaining plasma Cells senescence rate was tested by SAβgalactosidase staining method； cell cycle distribution was determined by flow cytometry； Cyclin D1， P21， and P53 mRNA were measured with RTPCR， and Cyclin D1 protein expression was measured by Western blot Results showed that after being induced by tBHP， senescence rate of HSCs was increased； cell proliferation ability was decreased； count of G0/G1 phase cells was increased； count of G2/M+S phase cells was reduced； Cyclin D1 expression was downregulated while P53， P21 expression was upregulated， which were reversed by Astragalus Radix + Angelicae Sinensis Radix 1∶1 and 10∶1， single Angelicae Sinensis Radix， and single Astragalus Radix plasma Furthermore， the above effects were most obvious in Astragalus Radix+Angelicae Sinensis Radix 1∶1 group These results suggested that tBHP can promote HSCs senescence and reduce cell proliferation ability Angelicae Sinensis Radix， Astragalus Radix and their combinations can inhibit HSCs senescence， promote HSCs proliferation as well as cell cycle conversion； moreover， the effects of 1∶1 Astragalus Radix+Angelicae Sinensis Radix were strongest The mechanisms may be related to upregulating the expression of cell cycle positive regulator， downregulating the expression of cell cycle negative regulator， thus promoting the cells to enter the proliferation phase from the stationary phase.endprint

[Key words]hematopoietic stem cells； senescence； proliferation； Astragalus Radix； Angelicae Sinensis Radix； cell cycle

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是機(jī)體內(nèi)具有自我更新和多向分化潛能的一類成體干細(xì)胞，是所有血細(xì)胞的始祖細(xì)胞，能分化為成熟血細(xì)胞以及某些非造血細(xì)胞[1]。既往研究表明，HSCs衰老可導(dǎo)致其增殖和分化功能低下，使血細(xì)胞發(fā)生失去正常調(diào)控，是多種造血功能障礙性疾病的重要原因。增齡和多種原因如放射線、抗腫瘤化療藥物等可引起骨髓HSCs衰老，導(dǎo)致其增殖和分化功能低下，從而使造血功能降低。因此，延緩HSCs衰老是防治骨髓造血功能低下的重要手段[2]。由李東垣創(chuàng)立的黃芪當(dāng)歸5∶1配伍的當(dāng)歸補(bǔ)血湯（Danggui Buxue Tang，DBT）是中醫(yī)治療血虛證的經(jīng)典方，有益氣補(bǔ)血的功效，具有促進(jìn)造血的作用[3]，可用于各種原因貧血的治療。研究表明，當(dāng)歸黃芪在1∶5～5∶1配伍均對(duì)促進(jìn)造血功能的恢復(fù)具有協(xié)同作用[4]。DBT的補(bǔ)血作用主要來源于當(dāng)歸 [5]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪和當(dāng)歸配伍比例在5∶1，25∶1，1∶1，1∶25，1∶5，1∶10時(shí)，可升高外周血細(xì)胞數(shù)，增加血清造血生長因子含量、骨髓有核細(xì)胞數(shù)和骨髓造血組織面積，降低脾指數(shù)，尤以黃芪當(dāng)歸1∶1，1∶25，1∶5配伍時(shí)發(fā)揮促造血的作用最強(qiáng)[6]。但黃芪當(dāng)歸配伍促造血作用的機(jī)制尚未完全弄清。為進(jìn)一步明確黃芪和當(dāng)歸配伍促造血的作用機(jī)制，作者采用體外造血干細(xì)胞衰老模型，比較黃芪當(dāng)歸不同配伍對(duì)細(xì)胞增殖及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，以明確黃芪當(dāng)歸配伍促造血作用的合理配伍關(guān)系，探討其作用機(jī)制，為黃芪當(dāng)歸配伍的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

11藥物黃芪，產(chǎn)地內(nèi)蒙古。當(dāng)歸，產(chǎn)地甘肅。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購進(jìn)并經(jīng)左亞杰教授鑒定。

12動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（湘）20110003。C57BL/6小鼠，6～8 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（湘）20120001。動(dòng)物由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)場地為湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，場地許可證號(hào)SCXK（湘）20130005。

13試劑胎牛血清（美國Hyclone，批號(hào)NWK0489）；IMDM培養(yǎng)液（美國Hyclone，批號(hào)NAG1440）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 74）（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)GNM20012）；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镉邢薰荆?hào)YZB/津15952011）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，美國MP Biomedicals，批號(hào)0218054210）；抗PE磁珠AntiPE MicroBeads（德國 Miltenyi 公司，批號(hào)130048701）；三丁基過氧化氫（Tertbutyl hydroperoxide，tBHP）（美國Sigma，批號(hào)STBD5969V）；衰老相關(guān)β半乳糖苷酶（senescence assiociated βgalactosidase，SAβgal）染色試劑盒（碧云天生物有限公司，批號(hào)CO602）；細(xì)胞周期檢測試劑盒（天津三箭生物技術(shù)有限公司，批號(hào)CY2001O）；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測（CCK8法）試劑盒（武漢博士德生物有限公司，批號(hào)AR1160500）；Sca1PE抗體（德國 Miltenyi 公司，批號(hào)130102297）；Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies，批號(hào)15596026）；First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TOYOBO公司）；Taq DNA Polymerase（Thermo scientific，批號(hào)114675526）；50×TAE（ASPEN，批號(hào)114675526）；瓊脂糖（ASPEN，批號(hào)111860）；GoldView I型核酸染色劑（Life sciences，批號(hào)20150810）；6×Loading Buffer（Takara公司，批號(hào)A6701A）；引物由Invitrogen Biotechnology Co LTD中國公司合成，引物序列為GAPDH：上游引物5′GAGGCCGGTGCTGAGTATGT3′，下游引物5′ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG3′，299 bp；Cyclin D1：上游引物5′GGATGAGAACAAGCAGACCATC3′，下游引物5′AGAAAGTGCGTTGTGCGGTA3′，186 bp；P53：上游引物5′TAAACGCTTCGAGATGTTCCG3′，下游引物5′AGCAGTTTGGGCTTTCCTCC3′，149 bp；P21：上游引物5′GCTGCCCAAGGTCTACCTGA3′，下游引物5′CAATCTGCGCTTGGAGTGATAG3′，244 bp。SDSPAGE凝膠制備試劑盒（ASPEN，批號(hào)114717460）；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（ASPEN，批號(hào)114675524）；RIPA總蛋白裂解液（ASPEN，批號(hào)114675671）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ASPEN，批號(hào)114717172）；磷酸化蛋白酶抑制劑（ASPEN，批號(hào)165482142）；兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體（Abcam公司，批號(hào)ab37168）；兔抗小鼠Cyclin D1單克隆抗體（Abcam公司，批號(hào)ab134175）；過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（KPL公司，批號(hào)150361）；045 μm PVDF膜（MilliPore公司，批號(hào)IPVH00010）；蛋白Marker（Thermo公司，批號(hào)00289411）。endprint

14儀器磁珠分選器MiniMACS Starting Kit（德國Miltenyi公司，批號(hào)130090312）；流式細(xì)胞儀（美國BectonDickinson公司）；酶標(biāo)儀（奧地利）；CO2培養(yǎng)箱（美國）；PCR儀（杭州博日科技）；電泳儀（北京六一儀器廠）；轉(zhuǎn)移電泳槽（北京六一儀器廠）；垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；酶標(biāo)儀（Diatek公司）。

2方法

21藥物及含藥血漿制備設(shè)立黃芪、當(dāng)歸、黃芪當(dāng)歸不同比例（10∶1，1∶1）配伍。稱取藥材，以水回流法提取3次，第1次加入8倍量水，加熱沸騰2 h。后2次加入6倍量水，加熱沸騰提取1 h，冷卻后傾出水溶液。合并3次水提液過濾后濃縮成質(zhì)量濃度分別為：黃芪05 g·mL-1（生藥）、當(dāng)歸05 g·mL-1（生藥）、黃芪當(dāng)歸不同比例配伍19 g·mL-1（生藥）。各藥液加入01%的苯甲酸鈉，分裝4 ℃冷藏備用。

含藥血漿制備：參照以往的方法[7]，清潔級(jí)SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，空白組（予等量雙蒸水）、單用黃芪組（10 g·kg-1）、單用當(dāng)歸組（10 g·kg-1）、黃芪當(dāng)歸1∶1配伍組（芪19 g·kg-1 +歸19 g·kg-1）、黃芪當(dāng)歸10∶1配伍組（芪345 g·kg-1 +歸35 g·kg-1），灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d后，于末次給藥后2 h腹主動(dòng)脈取血，以2%EDTA2Na抗凝，3 000 r·min-1離心15 min，取血漿即為含藥血漿或空白血漿，將同組各動(dòng)物血漿等量混合，分裝后-70 ℃保存。

22小鼠Sca1+HSCs分離和培養(yǎng)參照文獻(xiàn)方法[8]。小鼠處死后以75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下取出股骨和脛骨。用PBS[含2 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）、05%BSA]反復(fù)沖洗骨髓腔，通過4號(hào)針頭制備成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移至離心管中離心（3 000 r·min-1，15 min）后棄上清，加PBS制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液緩緩加入到盛有5 mL的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液離心管中，2 000 r·min-1離心20 min，輕輕吸取中間細(xì)胞層至新離心管中，離心后以PBS洗滌3次，最后以PBS懸浮細(xì)胞，即得骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow nucleated cells，MNCs）。

將上述分離的MNCs進(jìn)行免疫標(biāo)記：取MNCs加入90 μL PBS緩沖液（含2 mmol·L-1 EDTA，05%BSA，pH 74）和10 μL Anti Sca1PE抗體標(biāo)記細(xì)胞，4 ℃孵育10 min。 離心棄上清，加入80 μL PBS緩沖液和20 μL AntiPE MicroBeads，4 ℃孵育20 min。離心棄上清，以05 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入磁場分離柱內(nèi)，流出道收集未標(biāo)記細(xì)胞（即Sca1-細(xì)胞），05 mL緩沖液（PBS緩沖液加入2 mmol·L-1 EDTA，05%BSA，pH 72）洗柱3次，陽性細(xì)胞會(huì)留滯在柱內(nèi)，其他細(xì)胞流出分選柱。取下分選柱，加入05 mL緩沖液（同上）沖出標(biāo)記細(xì)胞（即Sca1+ HSCs）。分別收集分選前及分選后的細(xì)胞各1×106個(gè)，流式細(xì)胞儀檢測分選前后細(xì)胞的Sca1+陽性率。分選前MNCs的Sca1+細(xì)胞為17%，分離純化后 Sca1+ 細(xì)胞純度為892%。表明經(jīng)過磁珠分選后Sca1+HSCs純度遠(yuǎn)高于分選前。

將洗滌后的HSCs加10 mL培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，100 U·mL-1青霉素，100 g·L-1鏈霉素），接種培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37 ℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)。每2 d換液1次。

23tBHP誘導(dǎo)的Sca1+HSCs衰老模型的建立tBHP誘導(dǎo)Sca1+ HSCs衰老的時(shí)效關(guān)系：參照文獻(xiàn)方法[9]。實(shí)驗(yàn)用HSCs傳代細(xì)胞4～6代。將細(xì)胞接種于96孔板，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細(xì)胞生長同步化于G0期后，換成含tBHP（終濃度100 μmol·L-1）的IMDM完全培養(yǎng)基，1×105個(gè)細(xì)胞/100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)0，3，6，12，24 h后以CCK8試劑測定450 nm吸光度A，計(jì)算tBHP對(duì)HSCs生長的抑制率，抑制率（IR）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A空白組）×100%。以確定tBHP對(duì)HSCs損傷的合適時(shí)間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

tBHP誘導(dǎo)Sca1+ HSCs衰老的量效關(guān)系：在確定tBHP誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的合適時(shí)間（作用6 h）后，測定tBHP致細(xì)胞衰老的量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)用HSCs傳代細(xì)胞4～6代。將細(xì)胞接種于96孔板，使細(xì)胞生長同步化于G0期后，分別換成含不同終濃度

tBHP（0，25，50，100，200，400，800 μmol·L-1）的IMDM完全培養(yǎng)基，1×105個(gè)細(xì)胞/100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，同上采用CCK8試劑測定tBHP對(duì)HSCs生長的抑制率，以確定tBHP引起HSCs衰老的合適濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

衰老細(xì)胞的鑒定：采用衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色法鑒定。陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)色，陰性細(xì)胞不著色[10]。計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并計(jì)算陽性細(xì)胞率，陽性細(xì)胞率=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

24各含藥血漿促衰老Sca1+ HSCs增殖實(shí)驗(yàn)空白血漿的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用CCK8法測定細(xì)胞增殖能力以反映空白血漿對(duì)細(xì)胞的毒性。實(shí)驗(yàn)用傳代細(xì)胞4～6代。將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，1×105個(gè)/100 μL/孔，使細(xì)胞生長同步化于G0期，然后分別加入不同終濃度空白血漿（0%，1%，5%，10%，15%，20%），培養(yǎng)24 h后，以CCK8法測定，計(jì)算空白血漿對(duì)細(xì)胞生長的抑制率，抑制率（inhibition ratio，IR）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A空白組）×100%，取抑制率小于20%的血漿濃度作為無細(xì)胞毒性的血漿濃度[7]。

各含藥血漿促HSCs衰老模型細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期測定：在確定無細(xì)胞毒性血漿濃度（不超過10%）及tBHP誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的最佳時(shí)間為6 h和最佳濃度為100 μmol·L-1后，進(jìn)行各含藥血漿對(duì)細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期影響的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為無血漿空白對(duì)照組、模型組、空白血漿組、芪歸1∶1組、芪歸10∶1組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組。同前用HSCs傳代細(xì)胞4～6代。常規(guī)傳代培養(yǎng)后，加入不同濃度含藥血漿（0%，1%，5%，10%）和tBHP后培養(yǎng)6 h，按CCK8法測定450 nm的A以反映細(xì)胞增殖活性。endprint

各組細(xì)胞同上處理后以SAβ半乳糖苷酶染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，計(jì)算衰老細(xì)胞陽性率=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

運(yùn)用流式細(xì)胞分選術(shù)測定細(xì)胞周期。離心收集各組細(xì)胞1×106個(gè)，PBS洗滌1次，70%冰乙醇固定過夜，100 μL牛胰核糖核酸酶（1 g·L-1）37 ℃孵育30 min。 孵育后用碘化丙啶（propidium iodide，PI）1 mL（用001 mol·L-1 PBS 配制終濃度50 mg·L-1的PI工作液）4 ℃避光30 min染色，測定樣本細(xì)胞數(shù)不少于2×104個(gè)。計(jì)數(shù)G0期、G1期、S期、M期細(xì)胞百分比。

25RTPCR法測定Cyclin D1，P53，P21 mRNA的表達(dá)收集各組細(xì)胞，以Trizol試劑提取RNA，以紫外分光光度法測定A260和A280比值在18～22，說明RNA純度高，無蛋白污染。取2 μg RNA采用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，循環(huán)次數(shù)40次。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)各目的條帶進(jìn)行掃描，用Quantity One軟件（BioRad公司）分析各條帶OD值。計(jì)算各目的基因與內(nèi)參GAPDH的OD比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

26Western blot法測定Cyclin D1蛋白表達(dá)細(xì)胞處理同前。收集各組細(xì)胞，以PBS洗滌，以總蛋白提取試劑提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，95～100 ℃沸水浴5 min，冷卻后備用。然后進(jìn)行SDSPAGE電泳。電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。將完成轉(zhuǎn)移的PVDF膜以封閉液封閉，再加入用TBST（含5%脫脂奶粉）稀釋的兔抗鼠一抗（GAPDH一抗1∶1萬稀釋，Cyclin D1一抗1∶1萬稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，加入TBST（含5%脫脂奶粉）稀釋的羊抗兔二抗（1∶1 000稀釋），室溫孵育30 min，TBST洗4次。以ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行發(fā)光。AlPhaEaseFC圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的累積光密度值（integrated optical density，IOD）。以目的蛋白與GAPDH的IOD比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

27統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 160軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunner T3檢驗(yàn)。以P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31tBHP誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞衰老模型的建立tBHP誘導(dǎo)后，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，tBHP對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，到6 h抑制率達(dá)（4863±105）%，其后抑制率緩慢上升；隨著tBHP濃度增加，細(xì)胞生長抑制率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)終濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞生長抑制率為48%，其后生長抑制率緩慢上升。由此確定tBHP誘導(dǎo)細(xì)胞衰老（生長抑制）的最佳作用時(shí)間和濃度分別為6 h和100 μmol·L-1，見圖1。

32空白血漿的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)空白血漿濃度低于10%時(shí)細(xì)胞增殖抑制率小于20%。因此，取抑制率小于20%的血漿濃度（1%，5%，10%）作為無細(xì)胞毒性的血漿濃度，見圖2。

33各含藥血漿對(duì)細(xì)胞增殖的影響隨著含藥血漿濃度的增加，其促進(jìn)細(xì)胞增殖活性逐漸增強(qiáng)，呈量效關(guān)系。與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖活性顯著降低（P<001）。與空白血漿組比較，芪歸1∶1配伍組、10∶1配伍組、單用黃芪組、單用當(dāng)歸組不同濃度含藥血漿細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)（P<005，P<001），尤其在含藥血漿濃度為10%時(shí)，其細(xì)胞增殖力顯著高于空白血漿組（P<001）。與芪歸1∶1配伍組比較，芪歸10∶1配伍組、單用黃芪組、單用當(dāng)歸組在5%～10%含藥血漿濃度時(shí)，細(xì)胞增殖活性顯著低于芪歸1∶1配伍組（P<005，P<001），表明芪歸1∶1配伍組含藥血漿促衰老造血干細(xì)胞增殖的活性強(qiáng)于芪歸10∶1配伍組、單用黃芪組與單用當(dāng)歸組，見表1。

34各含藥血漿對(duì)細(xì)胞衰老的影響與空白對(duì)照組比較，模型組和空白血漿組衰老細(xì)胞陽性率顯著高于空白對(duì)照組（P<001）。與空白血漿組比較，芪歸1∶1配伍、10∶1配伍、單用黃芪、單用當(dāng)歸10%含藥血漿衰老細(xì)胞陽性率顯著降低（P<005，P<001）。與芪歸1∶1比較，芪歸10∶1配伍、單用黃芪、單用當(dāng)歸組衰老細(xì)胞陽性率顯著增加（P<005，P<001），見表2。

35各含藥血漿對(duì)細(xì)胞周期的影響與空白對(duì)照組比較，模型組和空白血漿組G0/G1期細(xì)胞顯著增多（P<001），G2/M+S期細(xì)胞顯著減少（P<001）。與空白血漿組比較，芪歸1∶1配伍組G0/G1期細(xì)胞顯著減少（P<001），G2/M+S期細(xì)胞顯著增加（P<001）。與芪歸1∶1配伍組比較，芪歸10∶1配伍組和單用黃芪組G0/G1期細(xì)胞顯著增多（P<005，P<001），G2/M+S期細(xì)胞顯著減少（P<005，P<001），單用當(dāng)歸組與芪歸1∶1配伍組比較，差異無顯著性，見表3。

36各含藥血漿對(duì)Cyclin D1，P53，P21 mRNA表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，模型組和空白血漿組Cyclin D1表達(dá)顯著降低（P<001），P53，P21表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<001）。與空白血漿組比較，芪歸1∶1配伍組、芪歸10∶1配伍組、單用黃芪組、單用當(dāng)歸組Cyclin D1表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<001），P53，P21表達(dá)均顯著降低（P<005，P<001）。與芪歸1∶1配伍組比較，芪歸10∶1配伍組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組Cyclin D1表達(dá)均顯著低于芪歸1∶1配伍組（P<001），P53，P21表達(dá)均顯著高于芪歸1∶1配伍組（P<001），見表4，圖3。

37各含藥血漿對(duì)Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，模型組和空白血漿組Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低（P<001）。與空白血漿組比較，芪歸1∶1配伍組、芪歸10∶1配伍組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組Cyclin D1蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<001）。與芪歸1∶1配伍組相比較，芪歸10∶1配伍組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組Cyclin D1蛋白表達(dá)均顯著低于芪歸1∶1組（P<005，P<001），見表5，圖4。endprint

MMarker；1空白對(duì)照組；2模型組；3空白血漿組；4芪歸1∶1組；5芪歸10∶1組；6單用當(dāng)歸組；7單用黃芪組。

4討論

骨髓造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSCs）是血液譜系中最重要的細(xì)胞，具有高度的自我更新、多向分化、跨系分化與重建長期造血的潛能，其作為一種組織特異性干細(xì)胞，通過不對(duì)稱分裂一方面維持自身數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定，另一方面生成多系或和單系造血祖細(xì)胞，以維持機(jī)體的正常造血功能。機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的活性氧分子、紫外線照射、電離輻射以及大多數(shù)化療藥物均可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞DNA損傷，這些損傷最終導(dǎo)致造血干細(xì)胞的衰老[11]。造血干細(xì)胞衰老可導(dǎo)致機(jī)體造血功能障礙，且組織修復(fù)能力降低、免疫功能下降。tBHP在體外可誘導(dǎo)HSC衰老，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖和多向分化能力降低，處于細(xì)胞周期活躍增殖的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞衰老重要標(biāo)志SAβgal表達(dá)增加[9]。本研究采用tBHP在體外成功誘導(dǎo)了HSCs衰老，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

DBT是補(bǔ)氣生血的經(jīng)典方，由黃芪當(dāng)歸5∶1配伍而成，對(duì)多種原因的造血功能障礙具有良好的治療作用?，F(xiàn)代藥理也表明，DBT組成藥物黃芪和當(dāng)歸有效成分黃芪多糖與當(dāng)歸多糖可延緩造血干細(xì)胞衰老。黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)CDK4，Cyclin D，P16等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)起到延緩HSCs衰老的作用[12]。在放射損傷的Sca1+ HSCs體內(nèi)衰老模型，當(dāng)歸多糖顯著降低了SAβ半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞百分率，抑制G1期細(xì)胞比例增加以及S期細(xì)胞比例減少，抑制衰老造血干細(xì)胞混合集落形成單位（mixed colony forming unit，CFUMix）數(shù)量的減少，其機(jī)制與抑制氧化損傷、調(diào)控細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)、抑制端粒損傷以及端粒酶活性下調(diào)有關(guān)[1315]。提示抑制HSCs衰老促進(jìn)造血功能的恢復(fù)可能是DBT促造血作用的重要機(jī)制。以往的研究表明，在骨髓造血功能抑制模型，黃芪和當(dāng)歸5∶1，25∶1，1∶1，1∶25，1∶5，1∶10配伍時(shí)，可升高外周血細(xì)胞數(shù)，增加血清造血生長因子含量和骨髓有核細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)造血祖細(xì)胞增殖，尤以黃芪當(dāng)歸1∶1，1∶25，1∶5配伍時(shí)發(fā)揮促造血的作用最強(qiáng)。提示黃芪和當(dāng)歸配伍促造血作用并不是經(jīng)典的5∶1配伍，而是在一定的范圍配伍均具有促進(jìn)造血作用。因此，本研究采用血漿藥理學(xué)方法，選擇黃芪和當(dāng)歸1∶1配伍（促造血作用最強(qiáng)）和10∶1配伍（促造血作用弱）2個(gè)配伍比例，進(jìn)一步從HSCs衰老研究了黃芪和當(dāng)歸配伍的促造血作用機(jī)制。結(jié)果表明，黃芪、當(dāng)歸、芪歸1∶1、芪歸10∶1配伍可促進(jìn)衰老的造血干細(xì)胞增殖，降低衰老細(xì)胞陽性率，減少細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞數(shù)，增加G2/M和S期細(xì)胞數(shù)，其中以芪歸1∶1配伍的作用最強(qiáng)。提示黃芪當(dāng)歸及其配伍可延緩HSCs衰老，通過促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換促進(jìn)了HSCs增殖，從而發(fā)揮其促造血作用。

細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程體現(xiàn)在細(xì)胞周期中。在細(xì)胞周期時(shí)相變化過程中，細(xì)胞由靜止進(jìn)入增殖、分化、衰老、凋亡和死亡等生理狀態(tài)，細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子，如INK4 家族（包括P16，P15，P18，P19）及CIP/KIP 家族（包括P21，P27，P57等）發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞將發(fā)生衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖[16]。細(xì)胞周期蛋白Cyclin是正性調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞周期啟動(dòng)復(fù)制，由G1期進(jìn)入S期。P53基因是一種抑癌基因，其編碼蛋白P53參與細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答，在維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性中起“分子警察”的作用。細(xì)胞衰老與細(xì)胞周期的停滯有關(guān)。P53可使P21的表達(dá)增強(qiáng)，結(jié)果一方面抑制CDK4/6Cyclin D1 復(fù)合物對(duì)Rb蛋白的磷酸化，另一方面抑制CDK2Cyclin E 復(fù)合物的活性，使細(xì)胞停滯于G1期，最終誘發(fā)細(xì)胞衰老的特征性改變[17]。P21能夠廣泛結(jié)合并抑制各種CyclinCDK復(fù)合物，包括Cyclin D/CDK4，Cyclin E/CDK2和 Cyclin A/CDK2，使Rb低磷酸化，不能釋放E2F，DNA合成受抑制，導(dǎo)致細(xì)胞不能進(jìn)入S期，停滯在G期，從而誘發(fā)細(xì)胞衰老[18]。本研究表明，tBHP作用于造血干細(xì)胞后，可使Cyclin D1表達(dá)降低，P53和P21表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞衰老，細(xì)胞增殖能力下降。黃芪、當(dāng)歸、芪歸1∶1配伍、芪歸10∶1配伍使Cyclin D1基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，P53和P21基因表達(dá)下調(diào)。而且芪歸1∶1配伍的作用強(qiáng)于黃芪、當(dāng)歸和芪歸10∶1配伍。提示黃芪當(dāng)歸配伍延緩造血干細(xì)胞衰老、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用與其上調(diào)細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)因子表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期有關(guān)。也表明黃芪和當(dāng)歸在合理的配伍下（如1∶1配伍）可發(fā)揮較好的延緩造血干細(xì)胞衰老、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint