王茉　陳穎　宋捷　孫娥　石子琪 封亮　賈曉斌　韋英杰

[摘要]日益顯現(xiàn)的壯骨中藥肝損傷問題為臨床應(yīng)用帶來挑戰(zhàn)，抗骨質(zhì)疏松中藥篩選有必要兼顧有效性與安全性，而代謝轉(zhuǎn)化至關(guān)效應(yīng)與毒性，故全面考慮代謝效/毒一體的篩選具有意義。評價模型和化合物（含代謝物）數(shù)量嚴重制約早期在體、高效篩選。參考課題組前期相關(guān)研究及國內(nèi)外文獻，提出斑馬魚代謝模型、骨質(zhì)疏松模型及毒性評價法有機整合可建立MAct/Tox（metabolismaction/toxicity）一體化的抗骨質(zhì)疏松中藥高效篩選法。突破量微成分無法在體、高效及一體化評價的難點和盲點，實現(xiàn)基于體內(nèi)過程且兼顧有效性與安全性的全方位抗骨質(zhì)疏松中藥高效篩選，對加速發(fā)現(xiàn)安全有效的抗骨質(zhì)疏松創(chuàng)新中藥具有意義。

[關(guān)鍵詞]斑馬魚； 骨質(zhì)疏松； 藥物代謝； 有效性； 安全性； 活性篩選

[Abstract]The increasingly apparent liver injury problems of bone strengthening Chinese medicines have brought challenges for clinical application， and it is necessary to consider both effectiveness and safety in screening antiosteoporosis Chinese medicines Metabolic transformation is closely related to drug efficacy and toxicity， so it is significant to comprehensively consider metabolismaction/toxicity（MAct/Tox） for screening antiosteoporosis Chinese medicines The current evaluation models and the number of compounds（including metabolites） severely restrict efficient screening in vivo By referring to previous relevant research and domestic and abroad literature， zebrafish MAct/Tox integrative method was put forward for efficiently screening antiosteoporosis herb medicines， which has organically integrated zebrafish metabolism model， osteoporosis model and toxicity evaluation method This method can break through the bottleneck and blind spots that trace compositions can′t achieve efficient and integrated in vivo evaluation， and realize both efficient and comprehensive screening on antiosteoporosis traditional medicines based on in vivo process taking both safety and effectiveness into account， which is significant to accelerate discovery of effective and safe innovative traditional Chinese medicines for osteoporosis.

[Key words]zebrafish； osteoporosis； metabolism； effectiveness； safety； activity screening

中藥治療骨質(zhì)疏松癥受到青睞，但其肝毒性也已引起重視，有些療效確切、臨床用藥廣、關(guān)注度高的知名中藥如壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆膠囊（《2012版中國國家基本藥物目錄》在列唯一補腎壯骨中成藥）等有肝臟不良反應(yīng)，且均已在《藥品不良反應(yīng)信息通報》公開，這對臨床安全、合理用藥帶來極大挑戰(zhàn)[13]。故抗骨質(zhì)疏松中藥篩選有必要既重視有效性，又重視安全性。中藥的效應(yīng)（action，Act）/毒性（toxicity，Tox）產(chǎn)生與其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化（metabolism，M）密切相關(guān)，全面考慮MAct/Tox的篩選具有意義。

嘗試建立基于體內(nèi)過程的中藥效/毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究的新思路、新方法不斷涌現(xiàn)[48]，但中藥成分復(fù)雜，所含的與分離到的成分多量微，現(xiàn)有體內(nèi)、外模型無法進行量微成分MAct/Tox一體化的在體、高效篩選：體外實驗不能體現(xiàn)在體轉(zhuǎn)化的綜合效果；體內(nèi)實驗周期較長、化合物用量大，不適于高效篩選。中藥成分復(fù)雜，大量成分含量低微，現(xiàn)有體內(nèi)、外模型難以進行中藥成分特別是量微成分的在體代謝轉(zhuǎn)化、效應(yīng)與毒性高效篩選，已成為制約中藥毒/效物質(zhì)高效篩選的難點、瓶頸。

本文提出采用模式生物斑馬魚可突破上述技術(shù)瓶頸，建立關(guān)注體內(nèi)、外成分，兼顧有效性與安全性的抗骨質(zhì)疏松篩選新方法，實現(xiàn)條件簡單，高效率，低成本，高靈敏，能高效進行微量樣品的在體MAct/Tox一體化評價，具重要意義。

1現(xiàn)有抗骨質(zhì)疏松中藥MAct/Tox篩選體內(nèi)、外模型不能進行量微成分在體、高效評價

11體內(nèi)模型常見在體抗骨質(zhì)疏松藥效模型：切除大鼠卵巢（睪丸）、用糖皮質(zhì)激素或維甲酸造成大鼠骨質(zhì)疏松模型，耗時長[910]；在體毒性模型有急毒小鼠或大鼠半月；亞急毒大鼠28 d；長毒大鼠3～6月或狗9月[11]；在體代謝常用大鼠，有時用狗[12]。endprint

體內(nèi)模型共有局限性：①耗時長、繁瑣、效率低；②靈敏度低、用藥量大，成本高，量微成分難以進行評價；③單一模型難以同時兼顧藥效、毒性與代謝評價；④一般不適于早期高效篩選。

12體外模型常見體外抗骨質(zhì)疏松藥效模型：采用體外培養(yǎng)原代成骨細胞和破骨細胞或其共培養(yǎng)技術(shù)，以及大鼠骨肉瘤UMR106細胞模型，要求高，難度較大[13]；體外毒性評價：常采用肝、腎等細胞毒模型；體外代謝：常采用肝細胞、肝微粒體、代謝酶或腸菌等手段。

體外模型共有局限性：①作用環(huán)節(jié)相對單一，不能體現(xiàn)在體試驗的綜合效果；②保持細胞生物活性的條件相對苛刻，普通實驗室難以進行；③需多種體外實驗方法聯(lián)合，才可進行體外代謝、效/毒的全面篩選。

綜上，現(xiàn)有體內(nèi)、外模型雖然系統(tǒng)性、可靠性強或長于機制探討，但無法實現(xiàn)量微成分代謝轉(zhuǎn)化與效/毒一體化的在體、高效篩選，已成為抗骨質(zhì)疏松中藥效/毒篩選的技術(shù)瓶頸。

2模式生物斑馬魚有望突破量微成分MAct/Tox一體化評價的技術(shù)瓶頸

模式生物斑馬魚（zebrafish）是近年來進行藥物在體高通量篩選、毒理研究等的理想、熱門模型。斑馬魚發(fā)育速度快，在1周內(nèi)形成主要的臟器及代謝酶系，斑馬魚與人類的基因相似度達到87%，這意味著在斑馬魚身上實驗的結(jié)果，在大多數(shù)情況下也適用于人體[1415]。與哺乳動物類似，藥物經(jīng)魚作用后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生藥效或毒性，是個整體過程，此外幼魚體小，實驗可在微板中高效進行，故采用斑馬魚有望建立MAct/Tox一體化評價模型，實現(xiàn)量微成分在體抗骨質(zhì)疏松的效/毒高效篩選的目標。

21斑馬魚用于抗骨質(zhì)疏松活性評價的依據(jù)與基礎(chǔ)斑馬魚與哺乳動物骨骼生長發(fā)育的分子機制極為相似，幼魚骨包含骨形成和骨吸收活動所需的細胞，是較完整體系。早在2005年，F(xiàn)leming等首次用斑馬魚骨骼染色得出結(jié)論：維他命D3類似物和甲狀旁腺素劑量與骨礦化面積成正相關(guān)性[16]，2006年，他們用腎上腺皮質(zhì)激素氫化潑尼松（prednisolone）誘導(dǎo)并成功建立斑馬魚骨質(zhì)疏松疾病模型[17]。

此后，斑馬魚作為高效、快速、高通量篩選促進骨骼生長、治療骨科疾病藥物的在體模型受到研究人員關(guān)注。Soon Nam Kim等用此在體模型驗證了甘草查爾酮A刺激骨形成、抑制骨重吸收并推測可能用于治療骨疾病[18]，SeongHee Moon等[19]用此在體模型驗證了三白草抗破骨細胞和促骨形成活性，Yu Jiang等[20]用此在體模型驗證了鐵調(diào)素抑制斑馬魚骨形成。

在國內(nèi)，課題組2013年首先建立了地塞米松和潑尼松龍（prednisolone，PN）誘導(dǎo)的斑馬魚骨骼異常模型[2124]，之后斑馬魚骨骼模型引起國內(nèi)越來越多課題組重視并進行相關(guān)研究，如闡述去鐵胺和鐵調(diào)素對高鐵環(huán)境下斑馬魚骨形成指標影響的實驗研究[25]，用斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評價一組2乙酰苯并五元雜環(huán)類化合物的抗骨質(zhì)疏松活性[26]，以及評價淫羊藿苷和朝藿定C單體混合物的活性等[27]。

22斑馬魚用于藥物代謝的依據(jù)與基礎(chǔ)[2830]斑馬魚具有較完善的代謝酶系，最大限度地保留哺乳動物代謝的系統(tǒng)性。前期課題組創(chuàng)建了斑馬魚中藥代謝新方法，突破量微成分在體代謝的技術(shù)瓶頸，也為代謝產(chǎn)物的富增提供新選擇：創(chuàng)新性的提出將斑馬魚置于含藥液的小容器或微板中，魚會通過皮膚和腔道自主連續(xù)的從溶液中吸收藥物，藥物代謝物也會隨著斑馬魚的排泄物被連續(xù)的排到水中，用LCMS分析魚體外藥液和魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物，可全面掌握代謝信息，方法簡易普適、化合物用量少（μg至數(shù)mg），低成本、批量規(guī)?；Ｑ芯勘砻?，斑馬魚即能用于藥物Ⅰ相、Ⅱ相代謝及腸菌代謝研究，又能體現(xiàn)多種代謝途徑的整體綜合結(jié)果。目前，斑馬魚代謝方法已成為一種被認可的、較成熟的在體代謝模型用于量微成分代謝研究。

23斑馬魚用于毒性評價現(xiàn)狀[3135]斑馬魚在藥學領(lǐng)域的最早、最為廣泛的應(yīng)用是毒性篩選。魚胚胎透明，低成本，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具保守性，存在很多與人類相同的生物學通路，及與哺乳動物的發(fā)育表型一致性，斑馬魚胚胎已成為一種在體毒性篩選的新工具。歐洲已認可斑馬魚的藥物毒性測試，F(xiàn)DA官員在2013年也倡議重視將斑馬魚用于藥品的毒性測試，我國近年來的相關(guān)研究也日益增多。

綜上，斑馬魚用于毒性篩選已被國內(nèi)外認可并應(yīng)用，課題組主持完成國家自然科學基金項目和江蘇省自然科學基金項目分別建立了“斑馬魚中藥代謝新方法”和“斑馬魚中藥壯骨效應(yīng)評價新模型”，突破量微成分在體代謝和抗骨質(zhì)疏松活性高效評價的技術(shù)難點與瓶頸。在用斑馬幼魚進行中藥抗骨質(zhì)疏松篩選研究中，發(fā)現(xiàn)藥物經(jīng)魚代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松活性，有時伴有毒性產(chǎn)生（如100 mg·L-1壯骨關(guān)節(jié)丸給藥3 d后致骨質(zhì)疏松模型魚100%死亡），故可推測給藥后，檢測抗骨質(zhì)疏松活性，另同步檢測代謝物及毒性，即可實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松中藥篩選的斑馬魚MAct/Tox一體化評價。斑馬魚MAct/Tox模型與現(xiàn)有體內(nèi)、外模型比較的優(yōu)勢見圖1。

3斑馬魚MAct/Tox一體化的抗骨質(zhì)疏松評價建立的思路與方法

斑馬魚MAct/Tox一體化評價思路與方法見圖2，本法旨在用斑馬魚進行抗骨質(zhì)疏松活性篩選過程中，進行代謝物的檢測與毒性觀察。取斑馬幼魚置微板中，分別用05%DMSO和糖皮質(zhì)激素處理，將魚分成健康陰性魚和骨質(zhì)疏松模型魚2類。2類魚分別給予測試藥（淫羊藿苷為代表），同時設(shè)留DMSO陰性及骨質(zhì)疏松模型組。給藥后，每天觀察魚毒性：計數(shù)魚死亡數(shù)量（計算半數(shù)致死濃度LC50），光學顯微鏡檢視主要臟器毒性；一定時間后，取一部分魚用于骨礦化檢測；另取一部分魚用于代謝物的LCMS分析，對于檢測到的代謝物可富集分離，再次進行效/毒評價。實驗僅需1 mg至數(shù)mg化合物，所需藥物濃度范圍寬，一般6～10個劑量，故所需魚數(shù)量較多（約幾百條），這用斑馬幼魚在微板上實驗易做到（24孔板，6～10條/孔）：一對成魚每次可產(chǎn)卵200～300個，單次接魚卵達1 000～2 000以上，易滿足需要。endprint

近年來，應(yīng)用范圍廣、社會關(guān)注度高的淫羊藿肝毒性（風險）已引起重視，現(xiàn)代研究表明淫羊藿黃酮類成分為抗骨質(zhì)疏松主要活性成分，其安全與否意義重大，淫羊藿苷（icariin）是廣受關(guān)注的主要代表黃酮成分之一。用上述思路與方法進行了微量（<2 mg）淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松MAct/Tox一體化評價：采用PN誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評價了淫羊藿苷的抗骨質(zhì)疏松活性，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷濃度為5，10 μmol·L-1時，斑馬魚頭骨染色面積之和與累積光密度IOD和模型組比有極顯著性差異（P<001），提示5，10 μmol·L-1淫羊藿苷可對抗PN誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松[36]。在抗骨質(zhì)疏松評價給藥過程中，觀察淫羊藿苷對魚的安全性，發(fā)現(xiàn)給藥期間最大濃度200 μmol·L-1未致健康魚和PN模型魚死亡，也未見魚臟器變形，提示淫羊藿苷安全性較好。另每天取藥液分析（3～8 d），發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷在斑馬魚作用下代謝轉(zhuǎn)化，見圖3，于給藥2 d后（5 dpf）基本代謝完全，轉(zhuǎn)化為主要代謝物寶藿苷I（baohuoside I），說明用斑馬魚進行抗骨質(zhì)疏松活性和安全性評價是基于體內(nèi)轉(zhuǎn)化的。

4討論與展望

抗骨質(zhì)疏松中藥早期篩選需面向3個問題：是否有效，何物質(zhì)有效（原形成分或代謝產(chǎn)物），及全安性如何？理想的篩選方法需進行基于體內(nèi)轉(zhuǎn)化的效應(yīng)/毒性的高效篩選，但現(xiàn)有體內(nèi)、外模型無法高效進行量微成分的在體代謝、抗骨質(zhì)疏松活性評價及毒性評價，是難點與瓶頸問題。

課題組前期建立了斑馬魚骨質(zhì)疏松模型和斑馬魚代謝新方法，發(fā)現(xiàn)在抗骨質(zhì)疏松中藥篩選過程中藥物會代謝轉(zhuǎn)化，也能觀察到毒性產(chǎn)生，故提出斑馬魚骨質(zhì)疏松模型、斑馬魚代謝新方法及斑馬魚毒性評價有機整合，形成斑馬魚代謝效應(yīng)/毒性（MAct/Tox）一體化評價新方法，可實現(xiàn)關(guān)注體內(nèi)、外成分且兼顧有效性與安全性的高效、系統(tǒng)篩選。實驗可在微板中進行，化合物用量少（μg～mg），周期短，為抗骨質(zhì)疏松中藥篩選提供新思路與方法，對發(fā)現(xiàn)安全、有效的抗骨質(zhì)疏松創(chuàng)新中藥具有意義。

[參考文獻]

[1]王伽伯，肖小河，杜曉曦，等 基于轉(zhuǎn)化毒理學的中藥肝損害客觀辨識與早期診斷[J]. 中國中藥雜志，2014，39（1）：5.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局警惕壯骨關(guān)節(jié)丸引起的肝損害[J]. 中國社區(qū)醫(yī)師，2009（8）：21.

[3]國家食品藥品監(jiān)督管理總局警惕仙靈骨葆口服制劑引起的肝損傷風險[R]. 藥物不良反應(yīng)信息通報（第72期），http：//wwwsdagovcn/WS01/CL0078/ 167184html.

[4]彭成，肖小河，李梢，等 中藥“毒與效”整合分析的研究進展和前沿分析[J]. 中國科學基金，2017（2）：176.

[5]閆蓉，張雪，何國榮，等 中藥“毒”與“效”的科學內(nèi)涵及物質(zhì)基礎(chǔ)探索[J]. 世界科學技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（5）：715.

[6]王喜軍 “血清藥物化學藥代（效）動力學系統(tǒng)生物學”三維整合體系研究中藥復(fù)方的構(gòu)建及其在茵陳蒿湯分析中的應(yīng)用[J]. 中國中藥雜志，2015，40（1）：13.

[7]徐風，楊東輝，尚明英，等 中藥藥效物質(zhì)的“顯效形式”、“疊加作用”和“毒性分散效應(yīng)”——由中藥體內(nèi)代謝研究引發(fā)的思考[J]. 世界科學技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（4）：688.

[8]楊秀偉 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥繼承、發(fā)展、創(chuàng)新的關(guān)鍵科學問題[J]. 中國中藥雜志，2015，40（17）：3429.

[9]武密山，趙素芝，任立中，等 淫羊藿苷元磷脂復(fù)合物防治去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失和提高骨質(zhì)量的實驗研究[J]. 中國中藥雜志，2013，38（13）：2163.

[10]解芳，張巖，吳春福，等 淫羊藿提取物對去卵巢大鼠骨轉(zhuǎn)換率增強的抑制作用[J]. 中草藥，2005，36（11）：1667.

[11]江振洲，王欣之，孫麗新，等 中藥毒性評價的技術(shù)方法與應(yīng)用[J]. 藥學進展，2013，37（11）：545.

[12]喬雪，果德安，葉敏 中藥體內(nèi)代謝研究的思路與方法[J]. 世界科學技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（4）：688.

[13]張大威，張金超，陳瑤，等 抗骨質(zhì)疏松藥物體外篩選試驗方法的探討[J]. 中國藥學雜志，2007，42（3）：161.

[14]Saad M，Matheeussen A，Bijttebier S，et al. In vitro CYPmediated drug metabolism in the zebrafish （embryo）using human reference compounds [J]. Toxicol In Vitro，2017，42：329.

[15]Yoganantharjah P，Gibert Y The use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation[J]. Curr Top Med Chem， 2017，17（18）：2041.

[16]Fleming A， Masahiko S， Goldsmith P. Highthroughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish[J]. J Biomol Screen，2005，10（8）：823.

[17]Barrett R， Chappell C， Quick M，et al. A rapid， high content，in vivo model of glucocorticoidinduced osteoporosis[J]. Biotechnol J，2006，1（6）：651.endprint

[18]Kim S N，Bae S J，Kwak H B，et al. In vitro and in vivo osteogenic activity of licochalcone A [J]. Amino Acids，2012，42：1455.

[19]Moon S H，Choi S W，Park S J，et al. In vitro and in vivo boneforming activity of Saururus chinensis extract [J]. Phytother Res，2015，29（7）：1073.

[20]Jiang Y，Yan Y L， Wang X，et al. Hepcidin inhibition on the effect of osteogenesis in zebrafish [J]. Biochem Biophys Res Commun，2016，476 （1）：1.

[21]韋英杰，王長梅，蔡雪婷，等 地塞米松影響骨骼發(fā)育的斑馬魚模型的建立[J]. 藥學學報，2013，48（2）：255.

[22]詹揚，韋英杰，孫娥，等 二維斑馬魚模型聯(lián)合色譜技術(shù)評價朝藿定A及其代謝物寶藿苷I抗骨質(zhì)疏松活性[J]. 藥學學報，2014，49（6）：932.

[23]韋英杰，景莉君，詹揚，等 二維斑馬魚模型聯(lián)合色譜技術(shù)高效篩選中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分的思路與方法[J]. 中國中藥雜志，2014，39（9）：1739.

[24]王長梅，景莉君，韋英杰，等 利用斑馬魚模型評價川續(xù)斷皂苷V和VI的抗骨質(zhì)疏松活性[J]. 中國藥科大學學報，2014，45（1）：88.

[25]Chen B，Yan Y L，Liu C，et al. Therapeutic effect of deferoxamine on iron overloadinduced inhibition of osteogenesis in a zebrafish model[J]. Calcif Tissue Int，2014，94（3）：353.

[26]薛司徒，秦偉，劉宗英，等 基于斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評價一組2乙酰苯并五元雜環(huán)類化合物的抗骨質(zhì)疏松活性[J]. 中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（3）：211.

[27]Huang M，F(xiàn)eng J，Xia P，et al. Bioactive study on mixtures of epimedin C and icariin monomers with invariant molarity to zebrafish osteoporosis model[J]. Chin Herb Med，2017，9 （1）：69.

[28]Wei Y J，Li P，F(xiàn)an H W，et al. Metabolite profiling of four major flavonoids of Herba Epimdii in zebrafish[J]. Molecules，2012，17（1）：420.

[29]韋英杰，薛小露，劉煒，等 模式生物斑馬魚對川續(xù)斷皂苷VI的代謝研究[J]. 藥學學報，2013，48（2）：281.

[30]寧青，韋英杰，王丹丹，等 斑馬魚藥物代謝模型的適用性研究進展[J]. 中草藥，2015，46（8）：1231.

[31]Hu G，Siu SO，Li S，et al. Metabolism of calycosin，an isoflavone from Astragali Radix，in zebrafish larvae [J]. Xenobiotica，2012，42（3）：294.

[32]Keon Y L，Gun H J，Cho H B，et al. Zebrafish models for functional and toxicological screening of nanoscale drug delivery systems：promoting preclinical applications [J]. Biosci Rep，2017，37（3）：BSR20170199.

[33]Raldúa D，Pia BIn vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity [J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2014，10（5）：685.

[34]彭蘊茹，韋英杰，丁永芳，等 基于斑馬魚模型的藥物毒性研究進展與中藥毒性研究新策略[J]. 中草藥，2017，48（1）：17.

[35]張勇，郭勝亞，鄧中平，等 斑馬魚在中藥毒性靶器官研究中的進展[J]. 中國新藥雜志，2016，25（12）：1343.

[36]詹揚，韋英杰，王長梅，等 基于斑馬魚模型評價量微淫羊藿苷和朝藿定B的抗骨質(zhì)疏松活性[J]. 中國藥學雜志，2014，49（1）：30

[責任編輯張寧寧]endprint