雒彩虹 亓 兵 于 浩

1.江蘇警官學(xué)院，江蘇 南京 210031；2.南京市公安局浦口分局，江蘇 南京 210000；3.南通市海安縣公安局，江蘇 南通 226601

Chelex-100法和硅珠法在玻璃指紋DNA檢驗中的比較研究*

雒彩虹1亓 兵2于 浩3

1.江蘇警官學(xué)院，江蘇 南京 210031；2.南京市公安局浦口分局，江蘇 南京 210000；3.南通市海安縣公安局，江蘇 南通 226601

目的：探討chelex-100法與硅珠法兩種提取方法在玻璃指紋DNA檢驗中的比較應(yīng)用。方法15名志愿者分別在載玻片和模擬現(xiàn)場窗玻璃上的指紋采樣，兩組采樣均分別用Chelex-100法與硅珠法提取，進行STR復(fù)合擴增和基因分型分析。結(jié)果在載玻片上的指紋，Chelex-100法檢出率要高于硅珠法的檢出率。在模擬現(xiàn)場玻璃上的指紋，兩種方法的檢出率都相對較低，但是硅珠法要稍高于chelex-100法。結(jié)論針對相對較干凈的汗?jié)撝讣y建議采用chelex-100方法進行提取擴增，避免硅珠法在提取過程中的損失；遇到檢材較差的汗?jié)撝讣y應(yīng)用硅珠法效果會好于chelex-100法，并且建議進行多次平行擴增。

法醫(yī)物證學(xué)；提取方法；STR分型；汗?jié)撝讣y

在實際案件中現(xiàn)場遺留的檢材多數(shù)是痕量DNA檢材，導(dǎo)致PCR擴增時只擁有低拷貝DNA模板[1]，而現(xiàn)階段玻璃上汗?jié)撝讣yDNA模板是公安實際工作中比較常見的。汗?jié)撝讣y指的是含有手指脊線分泌的脊線汗或粘有臉部皮膚皮脂汗的手指末端與客體接觸后，留下肉眼不能直接看見的指紋印跡[2]。汗?jié)撝讣y是在犯罪現(xiàn)場中比較常見的痕跡檢驗的物證，也是痕跡檢驗的重要檢測和研究對象。汗?jié)撝讣y中存在有比較微量的脫落細胞[2]。現(xiàn)如今隨著DNA檢測技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)實現(xiàn)了DNA檢測的微量化，讓我們對汗?jié)撝讣yDNA的檢測成為了可能。但是在基層相關(guān)汗?jié)撝讣y的DAN檢驗中，由于實際案件中遇到的指紋情況比較復(fù)雜，前期高效高質(zhì)量的提取過程對于后期等位基因的檢出率起到了至關(guān)重要的作用，在實踐過程中，只有找到最合適有效的方法，才能為后續(xù)的檢驗工作打下扎實的基礎(chǔ)。本文通過對模擬玻璃上汗?jié)撝讣yDNA的檢驗，初步探討實際案例中遇到相似檢材時的首選檢驗方法，為實際案例檢驗提供指導(dǎo)方案。具體將進行兩種現(xiàn)場的模擬，一種為載玻片上汗?jié)撝讣y的模擬，另外一種為實驗室窗戶外側(cè)玻璃上的汗?jié)撝讣y的模擬，然后分別采用Chelex-100法和硅珠法分別對模擬的汗?jié)撝讣y進行提取、擴增、檢測，分析統(tǒng)計兩種不同提取方法，對等位基因檢出率情況進行總結(jié)，進而達到比較優(yōu)劣的情況。

一、材料與方法

(一)樣本

15名志愿者分別雙手食指、中指、無名指以約1.5kg的力度按壓在載玻片上，時間大約5s，24小時后同一時間同樣的方法按壓在實驗室窗戶外側(cè)玻璃上。按壓在載玻片上的統(tǒng)一歸為A組，按壓在實驗室窗戶外側(cè)玻璃上的統(tǒng)一歸為B組。A組中所有15名志愿者左手共45枚指紋分別標(biāo)為A1、A2……A45，A組中所有15名志愿者右手共45枚指紋標(biāo)為A1-2、A2-2……A45-2。B組中所有15名志愿者左手共45枚指紋分別標(biāo)為B1、B2……B45，B組中所有15名志愿者右手共45枚指紋分別標(biāo)為B1-2、B2-2……B45-2。

(二)提取方法

A組中45枚指紋A1、A2……A45和B組中45枚指紋B1、B2……B45分別用Chelex-100方法提取[3]，A組中45枚指紋A1-2、A2-2……A45-2和B組中45枚指紋B1-2、B2-2……B45-2分別按照硅珠法進行提取[4-5]。其中Chelex-100法中用20μl體系，硅珠法中用20μl進行洗脫。均快速離心后進行擴增。

(三)擴增體系

本實驗采用的是美國ABI公司生產(chǎn)的AmpFlSTR Identifiler Plus試劑盒(即ID Plus)，ID Plus試劑盒所采用的是ABI公司(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)的五色熒光技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)16個STR位點同時擴增、檢測。ID Plus試劑盒包括全部16個位點PCR擴增所需要的引物(Primer set)，Taq酶，PCR擴增試劑(Mix)以及陽性對照9947A。

本實驗采用的擴增體系(見表1)。

因為DNA模板量較少，我們其他條件不變，將循環(huán)次數(shù)改為30次[6]，具體步驟為95°C熱啟動11min，94°C變性20s，59°C退火和延伸3min，變性、退火、延伸循環(huán)30次，60°C延伸10min，最后4°C恒溫保存。

(四)等位基因檢測

利用移液器吸取1.5μl的擴增液至另一個96孔板中，再按照一定的比例加入Liz500和HIDI溶液，并設(shè)置兩個Ladder，最后放入3500XL基因分析儀中進行分析，利用Genemapper ID-X軟件測定樣品片段大小與同一凝膠或一批加樣的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(Ladder)比對，進行基因分型。

二、結(jié)果

根據(jù)AmpFlSTR Identifiler Plus試劑盒用戶手冊中推薦的PCR擴增循環(huán)數(shù)為28次循環(huán)，推薦體系為25μl體系，可有效檢出的最低模板量為0.05ng，即模板DNA量大于等于0.05ng時，DNA檢測結(jié)果能夠明確判讀；而當(dāng)模板DNA量低于0.05ng時，檢測結(jié)果則無法正確判讀。本文中采用國內(nèi)通用的擴增體系10ul進行擴增，并增加2個循環(huán)數(shù)進行擴增。然后利用3500XL進行檢測。本實驗采用純合子大于150熒光單位，雜合子大于75個熒光單位進行判讀，低于此標(biāo)準(zhǔn)不進行統(tǒng)計。

表2 A組實驗結(jié)果分析

表3 B組實驗結(jié)果分析

(一)擴增體系對汗?jié)撝讣yDNA影響

汗?jié)撝讣yDNA屬于微量檢材，其含有較低濃度的DNA分子，故我們將其循環(huán)數(shù)增加2個，以增加DNA的檢出率，增加2個循環(huán)數(shù)對DNA的非特異擴增及不平衡擴增影響不大，但可以有效增加DNA濃度。

(二)2種方法的實驗結(jié)果比較

由表2可知，在載玻片上的模擬汗?jié)撝讣y，Chelex-100法檢出率要高于硅珠法的檢出率，分析其原因chelex-100法對檢材沒有損耗，而硅珠法步驟相對繁瑣，再加上DNA分子量少時，硅珠結(jié)合率也不高，致使此結(jié)果的出現(xiàn)。因此我們認為在公安實際工作中遇到案發(fā)現(xiàn)場遺留在玻璃制品上的相對干凈的殘缺汗?jié)撝讣y采用Chelex-100法效果要相對較好。

在模擬實際現(xiàn)場玻璃外側(cè)指紋的檢測時，兩種方法的檢出率都相對較低，但是總的來講硅珠法要稍高于chelex-100法，分析原因可能為現(xiàn)場檢材中有較多的灰塵等雜質(zhì)，硅珠法能有效的去除這些抑制物，而chelex-100法雖沒有損耗，但是對于這些抑制物確無法進行去除，直接影響了DNA的擴增效率，影響到了檢測結(jié)果。對實際情況中遇到檢材較差的汗?jié)撝讣y應(yīng)用硅珠法效果會好于chelex-100法，并且建議進行多次平行擴增，可以得到部分完整的DNA分型。

三、討論

本實驗中采用了兩種提取方法，并且分別對兩種不同的模擬汗?jié)撝讣y進行了提取與檢測。汗?jié)撝讣y中的DNA含量不同的人相差很大，這和個體因素有很大關(guān)系，本試驗中有的個體無論是模擬載玻片上的汗?jié)撝讣y還是模擬實驗室窗戶外側(cè)玻璃上的汗?jié)撝讣y，DNA檢出率都相對較高，而有一名志愿者無論哪種方式，均未獲得等位基因。這種個體之間的差異和本人的代謝水平有直接聯(lián)系，對于代謝旺盛，出汗較多的個體相對檢出率要高，而對于那些代謝水平較低的檢出率也低。在實際公安工作中，好多盜竊嫌疑人的心理素質(zhì)也很重要，對于那些慣犯，心理素質(zhì)強的，檢出率同樣較低，而那些心理素質(zhì)差，新手，盜竊財物時比較緊張的檢出率也較高。本實驗未考慮個體之間的差異以及其心理素質(zhì)等方面的問題，如有可能，可以對這幾方面進行深入研究。不過通過對本次實驗的設(shè)計，筆者認為以后對這種微量的汗?jié)撝讣yDNA可以進行多次平行擴增，以期待能得到好的結(jié)果。

在實際公安工作中，較干凈的汗?jié)撝讣y碰到的比較少，筆者在實際工作中提取到的較干凈的指紋一般是嫌疑人翻動受害人家中玻璃制品時留下的殘缺指紋，對這類相對較干凈的汗?jié)撝讣y建議采用chelex-100方法進行提取擴增，避免硅珠法在提取過程中的損失，得出完整分型的可能性要大于硅珠法。而對于受害人室外玻璃上較臟的殘缺指紋建議采用硅珠法進行提取，因為這類檢材中含有較多的雜質(zhì)，會影響擴增效率，硅珠法的最大優(yōu)點就是可以有效的除去這類雜質(zhì)，減少對擴增效率的影響。針對汗?jié)撝讣y這種微量檢材進行相應(yīng)的平行擴增，對增加得到完整DNA圖譜的概率有很大幫助。

[1]GILL P.Application of low copy number DNA profiling[J].Croatian Medical Journal，2001，42(3)：229-232.

[2]王桂強.指印的光學(xué)顯現(xiàn)和照相技術(shù)[M].北京：群眾出版社，2001.25.

[3]WalshBS，MetzgerDA，HiguchiR.Chelex-100 asmedium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].Biotechnics，1991，10(6)：506-513.

[4]Stacy FR，Jakonbsen.Reliable nonivnasive genotyping based on excremental PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol[M].Molecular Ecology，1999，8(5)：879.

[5]鄭秀芳，凌鳳俊，涂政，等.模板DNA磁珠提取法[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2003，18(2)：107.

[6]GillP，WhitakerJ，F(xiàn)laxmanC，etal.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100pg of DNA[J].Forensic Science International，2000，112(1)：17-40.

ComparativestudyofChelex-100andsiliconbeadmethodinDNAinspectionofglassfingerprints

LUO Cai-hong，QI Bing，YU Hao

1.Jiangsu Police Institute，Nanjing 210031，China；2.Nanjing Public Security Bureau Pukou branch，Nanjing 210000，China；3.Haian County Public Security Bureau of Nantong，Nantong 226601，China

Objective:To compare the two extraction methods of Chelex-100 and silicon beads in DNA examination of glass fingerprints.MethodsThe fingerprints of 15 volunteers were sampled on slides and simulated window glass，and two groups of samples were extracted by Chelex-100 and silica beads，respectively.STR amplification and genotyping were performed.ResultsIn the slide fingerprints，the detection rate of Chelex-100 was higher than that of silica beads.in the glass fingerprints of the simulation field，the detection rate of the two methods is relatively low，but the silicon beads should be slightly higher than the Chelex-100 method.ConclusionFor the relatively clean sweat latent fingerprints，Chelex-100 method is suggested to extract and amplify，avoiding the loss of silicon beads in the extraction process；When the sweat fingerprints are poor，the bead method is better than the Chelex-100 method，and multiple parallel amplification is recommended.

Forensic biological evidence；Extraction method；STR typing；Sweat latent fingerprints

*江蘇警官學(xué)院院級青年科研項目“基層公安機關(guān)DNA實驗室規(guī)范性建設(shè)研究”(2014SJYZQ02)。

D919

A

2095-4379-(2017)32-0049-03

雒彩虹(1983-)，女，碩士研究生，江蘇警官學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，助教，研究方向：法醫(yī)物證。