呂全 孫曉東 許時燕

在臨床醫(yī)學中，血涂片的顯微鏡檢查是血液細胞學檢查的基本方法[1]，對多種血液疾病的診斷具有重要價值[2]。血涂片鏡檢法迄今仍是瘧疾診斷最直接可靠的方法[3]，是瘧原蟲檢測金標準[4-5]，也是我國消除瘧疾行動計劃推薦瘧疾診斷方法[6]。但是，血涂片的制備和染色不良，常使細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒別發(fā)生困難，甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)論。WHO建議正在消除瘧疾的國家應(yīng)維持有質(zhì)量保證的瘧原蟲鏡檢能力[7]，《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法（WS/T 569—2017）》行業(yè)標準[8]的頒布，為瘧原蟲檢測的血涂片制作與染色提供了統(tǒng)一的標準[5，9]，但未詳細規(guī)定載玻片的清潔標準，載玻片清潔與否從而成為影響瘧原蟲鏡檢質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了解市售不同預(yù)清潔載玻片涂制血涂片的質(zhì)量，為保障瘧原蟲鏡檢質(zhì)量提供科學依據(jù)，2018年9月開展本項研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）血樣。實驗前用肝素鈉真空采血管采集1名研究者靜脈血2 mL，采血管上下顛倒5次混均抗凝劑。

（2）載玻片。在互聯(lián)網(wǎng)上查閱或咨詢不同廠家和不同品牌載玻片的預(yù)清潔資料，收集市售不同預(yù)清潔新載玻片各50張。

1.2 研究方法

（1）對照載玻片。從本實驗室?guī)齑娴那鍧嵓墸╟lear glass）載玻片隨機抽取20張浸入有洗潔精的清水中浸泡30 min，用脫脂紗布逐一擦拭后用清水沖洗干凈，晾干后再用脫脂紗布將載玻片擦亮作為對照載玻片。

（2）血涂片制作。收集的每種載玻片各隨機抽取20張以及對照載玻片20張，用定量移液器取血1 μL為薄血膜血量，取4 μL為厚血膜血量，由本實驗室1名瘧疾專業(yè)技術(shù)人員按國家標準[8]用推片逐一涂制瘧原蟲檢測血涂片，其中厚血膜涂成直徑1 cm圓形，薄血膜涂成寬2 cm×長2.5 cm舌型，每片血涂片用記號筆標記載玻片預(yù)清潔等級和編號。

（3）血涂片染色。吉姆薩染液原液和pH7.2磷酸鹽緩沖液由本實驗室提供。血涂片自然陰干和薄血膜用甲醇溶液固定后，按國家標準規(guī)定的成批血涂片染色法[8]，用10槽玻璃染色缸加入2%吉氏工作液背靠背的染色20張血片，30 min后沖洗晾干。

1.3 觀察指標

2人盲法觀察每張染色血涂片，分別計數(shù)厚薄血膜上的針孔空洞數(shù)（空洞直徑＜0.5 mm）,油斑空洞數(shù)（空洞直徑明顯較針孔空洞大或直徑≥0.5 mm）和血膜脫落數(shù)，計數(shù)結(jié)果記錄在登記表。

1.4 統(tǒng)計學方法

用EXCEL 2010建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS 17.0軟件進行描述性統(tǒng)計分析，油斑空洞計算載玻片出現(xiàn)率以（%）表示，不同載玻片針孔空洞數(shù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后用t檢驗分析差異顯著性，顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 載玻片

共收集4種載玻片，100%為即用型預(yù)清潔載玻片，預(yù)清潔等級分為清潔級（clear glass）、標準級（standard grade）、超級（super grade）和病理級（pathology grade）。

2.2 質(zhì)量觀察

共染色100張血涂片，其中4種預(yù)清潔和對照載玻片共5種載玻片各染色20張。100張染色血涂片中，累計97張出現(xiàn)335個針孔空洞，3張對照載玻片未出現(xiàn)空洞，針孔空洞總出現(xiàn)率為97%（97/100），平均（3.35±1.77）個；5種載玻片涂制的血涂片針孔空洞數(shù)均呈正態(tài)分布（P＞0.05），方差齊（P=0.203），5種載玻片針孔空洞數(shù)間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；4種預(yù)清潔載玻片涂制的血涂片針孔空洞數(shù)均多于對照載玻片，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中超級清潔載玻片針孔空洞平均數(shù)最高（4.85±1.57）個。2張超級清潔載玻片涂制的血涂片分別出現(xiàn)油斑空洞1個和3個，空洞直徑均＜1 mm。油斑空洞總出現(xiàn)率為2%（2/100）。血膜脫落率為0。血涂片質(zhì)量觀察結(jié)果見表1。

3 討論

用顯微鏡觀察標本時用來放標本的玻璃片通常稱為顯微載玻片,其分類方法眾多,例如，按是否預(yù)清潔分為免洗載玻片和未免洗載玻片，按是否防脫分為普通載玻片和黏附載玻片，按能否做記號分為記號載玻片和普通載玻片，以及磨砂邊和拋光邊等。本研究中，筆者參照瘧疾臨床診斷和監(jiān)測的實際應(yīng)用而收集普通顯微載玻片，100%為即用型預(yù)清潔載玻片，其預(yù)清潔等級是按玻片盒上中文或英文標注歸類為清潔、標準、超級和病理級4種預(yù)清潔等級，但其清潔分級標準未查閱到相關(guān)文獻和資料。

WHO建議選擇質(zhì)量好的載玻片來涂制瘧原蟲檢測血涂片[10]，而霉變、灰塵和油污等低質(zhì)量載玻片將導(dǎo)致血膜脫落、涂片和染色質(zhì)量差，從而影響瘧原蟲鏡檢質(zhì)量，載玻片無論預(yù)清潔與否，涂制血涂片前必須清洗清潔和分包保存。然而我國新近頒布實施的《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》（WS/T 569—2017）國家標準未對載玻片的清洗清潔做詳細的規(guī)定，僅要求載玻片為無劃痕無油污的潔凈載玻片[8]。本研究收集到的4種載玻片100%為預(yù)清潔免洗載玻片，其中病理級載玻片采用塑料袋真空包裝，防霉效果略好于其余3種用塑料薄膜包裝載玻片。

針孔空洞普遍存在于薄血膜，肉眼觀察薄血膜常見細小的空洞無規(guī)律的分布于薄血膜，偶見厚血膜。研究發(fā)現(xiàn)血涂片針孔空洞出現(xiàn)率為97%，平均（3.35±1.77）個，甚至用洗潔精清洗過的對照載玻片出現(xiàn)率也高達85%（17/20），但清洗過的載玻片針孔空洞數(shù)明顯少于未清洗載玻片（P＜0.01），平均（1.75±1.12）個。研究同時發(fā)現(xiàn)僅針孔空洞數(shù)最多的超級清潔載玻片出現(xiàn)油斑空洞（10%），說明針孔空洞和油斑空洞均與載玻片上的油污有關(guān)，針孔空洞數(shù)越多，油斑出現(xiàn)的概率越大，而常用的洗潔精浸泡清洗方法不能完全清除載玻片表面油污。顯微鏡油鏡下觀察薄血膜油斑空洞周圍紅細胞堆積變形明顯，這在瘧原蟲檢測時會影響瘧原蟲蟲種判定和密度計數(shù)[10]，而針孔空洞周圍紅細胞重疊不明顯，不影響鏡檢質(zhì)量也不影響薄血膜整體外觀。本研究隨機抽取的100張載玻片未發(fā)現(xiàn)明細劃痕，染色的厚薄血膜也無血膜脫落。因此，新載玻片在未清洗清潔的情況下，除了超級清潔級載玻片外，其余3種預(yù)清潔載玻片涂制的瘧原蟲檢測血涂片滿足消除瘧疾臨床診斷和監(jiān)測質(zhì)量要求。

表1 不同預(yù)清潔載玻片涂制瘧原蟲檢測血涂片質(zhì)量比較

血膜制作和染色是影響瘧原蟲鏡檢質(zhì)量的關(guān)鍵因素[11-12]，但隨著即用型載玻片應(yīng)用，臨床檢驗中往往忽略了玻片質(zhì)量的把關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)市售的顯微載玻片大部分預(yù)清潔質(zhì)量尚可，在現(xiàn)場工作中可根據(jù)針孔空洞數(shù)和油斑空洞數(shù)預(yù)判載玻片的清潔質(zhì)量，一旦出現(xiàn)油斑空洞，該批載玻片建議清洗清潔后再用于涂制血涂片，而用于制作教學和瘧原蟲血涂片資源庫儲存時，新載玻片建議須清洗清潔，但清洗方法尚需改進。