楊 歡， 趙晨明， 朱曉敬， 李 洋， 鄭 濤， 管 維， 郭小林， 陳志強， 葉章群△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，武漢 430030 2湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430063 3武漢市普愛醫(yī)院泌尿外科，武漢 430033

重組草酸降解酶乳酸菌治療高草酸尿癥的實驗研究*

楊 歡1， 趙晨明1， 朱曉敬2， 李 洋2， 鄭 濤3， 管 維1， 郭小林1， 陳志強1， 葉章群1△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，武漢 4300302湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 4300633武漢市普愛醫(yī)院泌尿外科，武漢 430033

目的構(gòu)建表達重組草酸降解酶的乳酸菌，并探討對高草酸尿癥大鼠的治療作用。方法將草酸脫羧酶(oxalate decarboxylase，ODC)和草酸氧化酶(oxalate oxidase，OxO)基因與表達質(zhì)粒pMG36e重組，通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸菌MG1363中。在含100 mmol/L草酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，測量其生長情況及培養(yǎng)液中草酸含量變化。以含5%草酸食物喂養(yǎng)SD大鼠，并同時進行重組乳酸菌灌胃治療，1周后收集大鼠24 h尿液測量草酸含量。結(jié)果成功構(gòu)建重組pMG36e-ODC，pMG36e-OxO乳酸菌，兩者都可在含100 mmol/L草酸的培養(yǎng)液中生長，20 h左右開始進入對數(shù)期，40 h左右進入穩(wěn)定期。其中pMG36e-ODC乳酸菌可明顯降低培養(yǎng)液內(nèi)草酸濃度，48 h內(nèi)可降解30%，而培養(yǎng)pMG36e-OxO乳酸菌和正常乳酸菌后培養(yǎng)液中草酸含量無明顯變化，48 h內(nèi)草酸含量水平下降了約15%。pMG36e-ODC乳酸菌喂養(yǎng)可顯著降低高草酸飲食大鼠尿液中草酸含量。結(jié)論重組ODC乳酸菌可有效降解草酸，并可通過降解食物中草酸緩解模型大鼠高草酸尿癥。

草酸脫羧酶； 草酸氧化酶； 乳酸菌； 基因重組； 草酸鈣結(jié)石

尿石癥是泌尿外科的常見疾病之一，人群患病率約為5%～10%，伴有50%的復(fù)發(fā)率[1]，給患者帶來極大的身心痛苦和沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。草酸鈣結(jié)石是最常見的尿石成分類型，尿草酸和尿鈣升高均會增加草酸鈣結(jié)石形成的風(fēng)險，一項研究提示高草酸尿促進草酸鈣結(jié)晶形成的作用比高鈣尿大15倍[2]。尿草酸主要來源于肝臟合成的內(nèi)源性草酸和胃腸道從飲食中攝入的外源性草酸，人體中無降解草酸的代謝途徑，因此針對高草酸尿目前缺乏有效的防治措施。自然界中存在數(shù)種降解草酸的途徑，包括人體腸道菌群以及草酸脫羧酶(oxalate decarboxylase，ODC)和草酸氧化酶(oxalate oxidase，OxO)等。其中人體腸道寄生菌產(chǎn)甲酸草酸桿菌已被證明可有效緩解高草酸尿癥，預(yù)防草酸鈣結(jié)石[3]，但因其寄生條件苛刻，寄生成功率很低。其他腸道菌群如乳酸桿菌、雙歧桿菌等雖具有降解草酸的能力，但在體內(nèi)難以有效減少尿草酸排泄量[4]。草酸脫羧酶和草酸氧化酶分別來自于枯草芽孢桿菌和大麥，它們具有高效、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐高溫、耐酸等優(yōu)點，在治療高草酸尿癥方面顯示出良好的前景。本研究擬將草酸脫羧酶和草酸氧化酶基因通過基因重組技術(shù)轉(zhuǎn)入乳酸菌中，使其表達草酸降解酶，從而提高草酸降解效率，利用口服途徑降解食源性草酸，減少尿草酸排泄量，預(yù)防草酸鈣結(jié)石的形成。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌及大麥基因組(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)贈)；DNA凝膠回收試劑盒；乳酸菌表達質(zhì)粒pMG36e(BiovectorCo.，LTD)；大腸埃希菌DH5α菌；乳酸菌MG1363(BiovectorCo.，LTD)；MRS培養(yǎng)液(蛋白胨10 g、牛肉浸取物10 g、酵母提取液5 g、葡萄糖5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸二胺2 g、吐溫80 1 g、磷酸氫二鉀2 g、七水硫酸鎂0.2 g、七水硫酸錳0.05 g、碳酸鈣20 g、蒸餾水1 L)；乳酸菌感受態(tài)制備培養(yǎng)液(MRS+0.5 mol/L蔗糖+2.5%甘氨酸)；乳酸菌復(fù)蘇培養(yǎng)液(MRS+0.5 mol/L蔗糖+20 mmol/L氯化鎂)；PB緩沖液(5 mol/L蔗糖、10%甘油，用雙蒸水配制)。雌性SD大鼠購自同濟醫(yī)院動物中心，8周齡，體質(zhì)量200～220 g。

1.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR反應(yīng)引物，分別從枯草芽孢桿菌及大麥基因組中擴增提取草酸脫羧酶(ODC)及草酸氧化酶(OxO)編碼基因。目的基因兩端加入酶切位點(XbaⅠ：TCTAGA；HindⅢ：AAGCTT)。ODC上游引物5′-TCTAGAATGA-AAAAACAAAATGACATTC-3′，下游引物：5′-AAGCTTTTACTGCATTTCTTTTTCACTA-3′；OxO上游引物：5′-TCTAGAATGGGTTACTC-TAAAAACCTAGG-3′，下游引物：5′-AAGCTTTTAAGACCCACCGGC-3′。利用PCR反應(yīng)及DNA凝膠回收試劑盒擴增、純化ODC和OxO基因片段，經(jīng)測序確定序列正確后，利用XbaⅠ/HindⅢ雙酶切，并通過DNA連接酶連接到乳酸菌表達質(zhì)粒pMG36e上，如圖1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，平板選擇性培養(yǎng)，挑取單菌落，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序。

EMR為紅霉素抗性基因，p32啟動子后分別連接草酸脫羧酶和草酸氧化酶編碼基因圖1 重組質(zhì)粒pMG36e-ODC(左)和pMG36e-OxO(右)示意圖Fig.1 The schematic diagram of recombinant plasmids pMG36e-ODC(left)and pMG36e-OxO(right)

1.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化

乳酸菌電轉(zhuǎn)化：將乳酸菌MG1363在感受態(tài)制備培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)期，冷卻(將培養(yǎng)物置于冰上30 min)，6 000 r/min離心10 min，收集菌體，用PB緩沖液洗滌3次后，再用1 mL PB緩沖液重懸菌體，取50 μL新制備的感受態(tài)細胞懸液到預(yù)冷的無菌EP管中，加入1 μL重組質(zhì)粒，冰浴5 min，將此混合液加入預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)化杯中電場強度10 kV/cm，電阻200 Q、電容25 μF電擊，電擊完畢后迅速向電轉(zhuǎn)化杯中加入950 μL的復(fù)蘇培養(yǎng)液，混勻后倒入無菌EP管中，37℃靜置培養(yǎng)2 h，取用再生液體培養(yǎng)液稀釋后的電擊轉(zhuǎn)化細胞液100 μL，涂布到含紅霉素的MRS平板上，挑取紅霉素篩選的陽性菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后測序驗證。

1.4 重組乳酸菌體外降解草酸效果評估

將重組ODC基因乳酸菌(pMG36e-ODC Lab)、重組OxO基因乳酸菌(pMG36e-OxO Lab)以及正常乳酸菌(wild-type Lab)分別接種入含有100 mmol/L草酸的MRS培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)48 h，每4 h取2 mL培養(yǎng)液，利用分光光度計測量600 nm波長下吸光度(A600 nm)評估細菌生長情況；將培養(yǎng)液通過0.22 μm孔徑濾器，利用高效液相色譜法(HPLC)測量培養(yǎng)液中草酸濃度[5]。

1.5 動物實驗

將15只220～240 g雌性SD大鼠隨機分為3組，每組5只，全部給予含5%草酸的食物，第1組為對照組，第2組高草酸飲食的同時每天灌胃5×1010CFU pMG36e-ODC Lab，第3組高草酸飲食同時每天灌胃5×1010CFU pMG36e-OxO Lab[6]。1周后將所有大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，收集瓶中放入1 mL濃鹽酸防止維生素C等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為草酸。采用HPLC法測量尿液中草酸濃度，與尿液體積相乘計算得到24 h尿草酸量。應(yīng)用IBM SPSS軟件進行獨立樣本t檢驗，比較各組之間尿草酸含量的差異。

2 結(jié)果

2.1 重組草酸降解酶乳酸菌構(gòu)建成功

成功構(gòu)建pMG36e-ODC及pMG36e-OxO重組質(zhì)粒，并成功電轉(zhuǎn)入乳酸菌MG1363中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因乳酸菌后提取質(zhì)粒，利用雙酶切(XbaⅠ/HindⅢ)驗證，基因片段大小正確(圖2)，并經(jīng)過測序無誤。

1：pMG36e-ODC重組質(zhì)粒酶切；2：pMG36e-OxO重組質(zhì)粒酶切；3：pMG36e質(zhì)粒酶切圖2 重組質(zhì)粒pMG36e-ODC和pMG36e-OxO雙酶切(XbaⅠ/HindⅢ)驗證凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of recombinant plasmids pMG36e-ODC and pMG36e-OxO by the double enzyme digestion(XbaⅠ/HindⅢ)

2.2 重組乳酸菌降解草酸的體外實驗

wild-type Lab、pMG36e-ODC Lab和pMG36e-OxO Lab分別接種于含100 mmol/L草酸的MRS培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)48 h。pMG36e-ODC Lab和pMG36e-OxO Lab可在高濃度草酸環(huán)境中生長，約20 h后進入對數(shù)期，生長40 h后兩者都進入穩(wěn)定期。而wild-type Lab無法生長；pMG36e-ODC Lab可明顯減少培養(yǎng)液中草酸含量，48 h內(nèi)大約下降30%，而pMG36e-OxO Lab與wild-type Lab相比較，培養(yǎng)液內(nèi)草酸含量并無明顯下降。通過測量不同時間點培養(yǎng)液的A600 nm以及草酸濃度，繪制出生長曲線(圖3)以及草酸含量變化曲線(圖4)。

圖3 重組乳酸菌在含100 mmol/L草酸的MRS培養(yǎng)液中的生長曲線Fig.3 The growth curve of wild-type lab，recombinant Labs pMG36e-ODC and pMG36e-OxO in MRS culture medium containing 100 mmol/L oxalate

圖4 各組乳酸菌的MRS培養(yǎng)液中草酸濃度變化曲線Fig.4 The oxalate concentration curve of wild-type lab，recombinant Labs pMG36e-ODC and pMG36e-OxO in MRS culture medium

2.3 重組草酸降解酶乳酸菌飼養(yǎng)大鼠的體內(nèi)實驗

5%草酸喂食1周的對照組大鼠24 h尿草酸含量平均為(30.35±6.51) mg；第2組經(jīng)過pMG36e-ODC Lab灌胃治療，尿草酸含量為(20.71±5.02) mg，明顯低于對照組(P<0.05)；第3組經(jīng)過pMG36e-OxO Lab灌胃治療，尿草酸含量為(30.77±11.68) mg，與對照組比較并無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

高草酸尿癥是草酸鈣結(jié)石最主要的風(fēng)險因素之一，按起病原因可分為原發(fā)性高草酸尿，腸源性高草酸尿和特發(fā)性高草酸尿，其中特發(fā)性高草酸尿占絕大多數(shù)。實驗表明無論是正常人還是草酸鈣結(jié)石患者，高草酸飲食后尿草酸排泄量都會明顯增加，并且在特發(fā)性高草酸尿患者中草酸的吸收率明顯高于正常人[7]，相反高草酸尿患者經(jīng)過低草酸或者無草酸飲食調(diào)整后，尿草酸排泄量平均可下降5.7～18.9 mg/d[8]。因此通過降低食物中草酸攝取量是種可有效預(yù)防高草酸尿的方法。但草酸廣泛存在于各類蔬菜、水果、谷類等食物中，很難單純通過限制飲食達到減少食物來源草酸的目的。

乳酸菌是目前應(yīng)用最為廣泛的益生菌，同時也是一種理想的生物藥物載體，在治療代謝性疾病，口服疫苗等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。草酸脫羧酶和草酸氧化酶是自然界最常見的2種草酸降解酶，具有防治高草酸尿癥的潛力，但作為異源蛋白無論是通過腸道還是靜脈途徑都很容易被蛋白酶降解或引發(fā)免疫反應(yīng)而無法有效發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。因而我們將草酸降解酶基因通過基因重組技術(shù)轉(zhuǎn)入乳酸菌中，實現(xiàn)兩者的優(yōu)勢互補，使其持續(xù)表達草酸降解酶，可安全而高效地降解腸道中的草酸，減少草酸的吸收。

本實驗利用目前應(yīng)用最為廣泛而又簡便的表達質(zhì)粒pMG36e作為表達載體，將草酸脫羧酶基因和草酸氧化酶基因成功轉(zhuǎn)入乳酸菌中，pMG36e帶有乳酸菌啟動子p32，無需誘導(dǎo)便可持續(xù)表達。pMG36e-ODC Lab展現(xiàn)出了理想的降解草酸效率，而pMG36e-OxO Lab并無明顯的草酸降解效果。這可能與草酸脫羧酶和草酸氧化酶不同的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)[9]。雖然如此，我們成功構(gòu)建了一種可有效降解草酸的重組草酸脫羧酶基因的乳酸菌，通過口服途徑即可在腸道中充分發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在動物實驗中取得了理想緩解高草酸尿癥的效果。理論上乳酸菌不僅可安全口服，并可以在人體腸道中正常寄生，因此口服表達草酸脫羧酶的乳酸菌是種簡單、安全而又持續(xù)有效的防治高草酸尿癥的方法，為預(yù)防草酸鈣結(jié)石提供了一種新的思路。

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TreatmentofHyperoxaluriawithRecombinantLactobacilluspMG36e-ODC

Yang Huan1，Zhao Chenming1，Zhu Xiaojing2et al

1DepartmentofUrology，TongjiHospital，TongjijiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2CollegeofLifeScience，HubeiUniversity，Wuhan430063，China

ObjectiveTo transfer oxalate decarboxylase(ODC)and oxalate oxidase(OxO)into Lactobacillus(Lab)to express oxalate-degrading enzyme，which could continuously degrade oxalate，degrade dietary oxalate via oral administration and prevent the formation of calcium oxalate stones.MethodsRecombinant plasmids pMG36e expressing ODC or OxO were established and electrotransformed into Labs MG1363，which were cultured in the medium containing 100 mmol/L oxalate for 48 h to examine the oxalate degradation.SD rats were fed on 5% oxalate diet and treated with recombinant Labs by gavage.One week later，the 24-h urinary oxalate content was measured.ResultsThe recombinant Labs pMG36e-ODC and pMG36e-OxO were successfully constructed and both could grow in oxalate-containing medium.The growth curve showed that the logarithmic phase began at about 20 h and the stable phase at about 40 h.The recombinant Lab pMG36e-ODC could degrade oxalate significantly，by 30% in 48 h，while the recombinant Lab pMG36e-OxO and the wild type Lab showed little efficiency，and they decreased oxalate by nearly 15% in 48 h.Additionally，the recombinant Lab pMG36e-ODC could significantly decrease the amount of urinary oxalate in rats on high oxalate diet.ConclusionThe recombinant Lab pMG36e-ODC degrades oxalate effectively and prevents hyperoxaluria by reducing dietary oxalate.

oxalate decarboxylase； oxalate oxidase； lactic acid bacteria； gene recombination； calcium oxalate stones

*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81270788，No.81500534，No.81370805)；湖北省自然科學(xué)基金資助項目(No.2015CFB289，No.2012FFB02412，No.2013CFB174)；武漢市青年科技晨光計劃項目(No.2013072304010833，No.2015070404010199)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師基金(No.20130142120072)

楊 歡，男，1980年生，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，講師，E-mail：yhpz123@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：zhangqun-ye@163.com

R692.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.013

(2017-06-18 收稿)