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(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023;2.大連醫(yī)諾生物有限公司,遼寧大連 116600)

葉黃素與玉米黃質(zhì)協(xié)同抗氧化活性的研究

任丹丹1,2,張海麗1,王惜童1,薛凌云2,吳文忠2

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023;2.大連醫(yī)諾生物有限公司,遼寧大連 116600)

葉黃素和玉米黃質(zhì)是人類眼睛中主要的類胡蘿卜素,它們對(duì)預(yù)防眼部疾病具有重要作用。本文通過(guò)研究不同比例的葉黃素和玉米黃質(zhì)在體內(nèi)和體外的抗氧化活性,探討其協(xié)同抗氧化活性,為復(fù)合類胡蘿卜素產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。通過(guò)DPPH自由基清除體系、FRAP法和ORAC法三種方法探討了葉黃素和玉米黃質(zhì)之間的體外協(xié)同抗氧化活性。通過(guò)建立ICR小鼠體內(nèi)乙醇氧化損傷模型,考察葉黃素和玉米黃質(zhì)在體內(nèi)的協(xié)同抗氧化活性。結(jié)果表明:葉黃素與玉米黃質(zhì)以1∶2比例存在時(shí)體外協(xié)同抗氧化效果最佳,2∶1效果較差。葉黃素/玉米黃質(zhì)(1∶2)組在各個(gè)指標(biāo)上顯示出更強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性。

葉黃素,玉米黃質(zhì),協(xié)同抗氧化

類胡蘿卜素是一類具有多個(gè)共軛雙鍵的萜烯基團(tuán)的化合物,迄今已發(fā)現(xiàn)了700多種類胡蘿卜素。流行病學(xué)調(diào)查,動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,類胡蘿卜素具有較強(qiáng)抗癌、抗輻射和預(yù)防心血管疾病等作用[1]。類胡蘿卜素的這些保護(hù)作用都直接或間接地與其抗氧化作用有關(guān)。有些類胡蘿卜素在人體組織器官中發(fā)揮重要作用,如葉黃素和玉米黃質(zhì)是視網(wǎng)膜黃斑的組成成分。臨床研究發(fā)現(xiàn)攝入葉黃素可以提高黃斑的色素含量,而且能夠提高老年性黃斑衰退癥(AMD)病人的視力[2],由于葉黃素能夠清除自由基并且能夠吸收藍(lán)光,進(jìn)而可以預(yù)防白內(nèi)障和防止對(duì)眼睛的損傷,而葉黃素與玉米黃質(zhì)以適宜的比例存在，對(duì)視力的保護(hù)效果更好[3-4]。因此,研究葉黃素與玉米黃質(zhì)的協(xié)同抗氧化效果對(duì)更進(jìn)一步深入研究葉黃素與玉米黃質(zhì)對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用具有重要意義。本文將從體內(nèi)外兩個(gè)方面,研究不同比例葉黃素和玉米黃質(zhì)產(chǎn)品的協(xié)同抗氧化活性,旨在為類胡蘿卜素產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

葉黃素 冷水可溶(Cold water soluble,簡(jiǎn)稱CWS)；CWS5%微囊粉,玉米黃質(zhì)CWS5%微囊粉,維生素E 大連醫(yī)諾生物有限公司;SPF級(jí)雄性ICR小鼠 體質(zhì)量18～22 g,80只,大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、蛋白質(zhì)羰基(POC)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;實(shí)驗(yàn)所用各種試劑及藥品 國(guó)產(chǎn)分析純。

FE20 pH計(jì)、AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;SynergyH1酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司;SHA-BA水浴恒溫振蕩器 金壇市順華儀器有限公司;CR22G 型高速冷凍離心機(jī) 日立公司;低溫高速離心機(jī) Thermo Fisher公司;HH-4型顯數(shù)恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;PE Lambda25紫外可見分光光度計(jì) PerkinElmer Co.。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 類胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基的清除作用 參照熊雙麗和惲祥慧[5-10]等報(bào)道的方法,稍加改動(dòng)后應(yīng)用于96孔板中。依次在酶標(biāo)板的每孔中加入40 μL不同濃度維生素E或樣品液和160 μL 0.12 mmol/L的DPPH乙醇溶液。在25 ℃條件下反應(yīng)30 min后,在517 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。采用樣品溶劑代替樣品作為對(duì)照組,無(wú)水乙醇替代DPPH溶液作為樣品空白組。樣品清除率計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式中:A0,A1,A2分別代表對(duì)照(不加樣)、樣品和樣品空白(不加DPPH)測(cè)出的吸光度。

1.2.2 類胡蘿卜素對(duì)鐵離子的還原能力(FRAP) 參照Benzie和惲祥慧[6,11-13]等報(bào)道的方法,稍加改動(dòng)后應(yīng)用于96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),即新鮮配制150 μL 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)工作液與5 μL不同濃度FeSO4(0.1～1.6 mmol/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合于96孔板中,以蒸餾水作為空白對(duì)照,將96孔板置于酶標(biāo)儀中振搖1 min后,在37 ℃下溫育40 min,593 nm處測(cè)定其吸光度并繪制濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以類胡蘿卜素樣品溶液代替FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液即可測(cè)得樣品吸光度值的變化,然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得FRAP值。樣品的鐵離子還原能力(FRAP值)以達(dá)到相同吸光度所需FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

1.2.3 類胡蘿卜素的氧自由基吸收能力(ORAC) 參照李紅艷和王曉宇[14-19]等報(bào)道的方法并稍加改動(dòng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在96孔板中依次加入25μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑(Trolox)溶液和150 μL熒光素鈉鹽溶液(0.0861 nmol/L),然后將96孔板放入熒光酶標(biāo)儀中,用gene5軟件編程操作,37 ℃預(yù)熱10 min后,迅速加入AAPH溶液25 μL(153 mmol/L),持續(xù)振蕩,在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)538 nm下用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定。初始熒光強(qiáng)度值記為F0,每2 min測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度(Fn),熒光衰減呈基線后停止(本實(shí)驗(yàn)與設(shè)定時(shí)間為2.5 h)。設(shè)定空白對(duì)照,即用緩沖液代替抗氧化劑作為對(duì)照(+AAPH)。

通過(guò)gene5軟件將實(shí)驗(yàn)所得各微孔反應(yīng)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)輸出到Excel表格中進(jìn)一步處理。各微孔不同時(shí)間點(diǎn)的絕對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)與初始熒光強(qiáng)度(F0)的比值即為相對(duì)熒光強(qiáng)度f(wàn)i;再根據(jù)以下公式計(jì)算衰減曲線下的面積及保護(hù)面積(NetAUC),以Trolox濃度為橫坐標(biāo),保護(hù)面積NetAUC為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

AUC=2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn

注:初始相對(duì)熒光強(qiáng)度即為f0,每隔2 min測(cè)定一次,相對(duì)熒光強(qiáng)度分別記為f0,f2…fn。

保護(hù)面積NetAUC=AUC抗氧化劑-AUC+AAPH

按照Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中所述方法,以類胡蘿卜素產(chǎn)品代替Trolox標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑溶液,測(cè)定一定濃度下保護(hù)面積。將樣品在自由基作用下熒光衰退曲線的延緩部分面積(NetAUC)代入標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)Trolox的NetAUC與Trolox濃度所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出與各樣品濃度的氧自由基清除能力等價(jià)的Trolox濃度,再轉(zhuǎn)換成以μmol Trolox當(dāng)量/g類胡蘿卜素表示(μmol Trolox/g)即ORAC值。

1.2.4 類胡蘿卜素對(duì)乙醇氧化損傷模型小鼠抗氧化作用 將70只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為7組,每組10只。分別為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組(天然VE),葉黃素CWS微囊粉、玉米黃質(zhì)微囊粉、葉黃素與玉米黃質(zhì)不同比例混合組,各組均用0.5% CMC-Na溶解。分組與劑量見表1。各組動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),樣品組每天分別灌胃不同劑型葉黃素產(chǎn)品和玉米黃質(zhì)受試樣品,連續(xù)灌胃30 d。末次灌胃后,模型對(duì)照組和各樣品劑量組一次性灌胃50%乙醇12 mL/kg·BW,空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水,6 h后小鼠摘眼球取血,收集血液,頸椎脫臼處死小鼠。

表1 分組與劑量Table 1 The group and dosage

將小鼠血液在3500 r/min,4 ℃下離心10 min,取血清,用試劑盒測(cè)定血清中GSH、MDA含量以及GSH-PX、SOD活力。取肝右葉組織制成10% 肝組織勻漿,用試劑盒測(cè)定GSH、SOD、GSH-Px、MDA和蛋白質(zhì)羰基各指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1對(duì)體外DPPH·清除效果比較

葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品之間協(xié)同對(duì)DPPH·清除效果如表2所示。

表2 不同比例的葉黃素與玉米黃質(zhì)組合對(duì)DPPH·清除效果Table 2 The scavenging DPPH· activity of lutein and zeaxanthin with different combination

注:通過(guò)LSD和Student-Newma-Keuls法進(jìn)行多重比較,同列上標(biāo)不同小寫字母表示有顯著差異(p<0.05),未標(biāo)明字母表示組間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。表3、表4同。

表3 不同比例的葉黃素與玉米黃質(zhì)組合對(duì)鐵離子的還原能力Table 3 The ferric reducing ability of lutein and zeaxanthin with different combination

表4 不同比例的葉黃素與玉米黃質(zhì)組合ORAC值Table 4 The ORAC value of lutein and zeaxanthin with different combination

從表2中可看出,當(dāng)葉黃素與玉米黃質(zhì)分別以5∶1、4∶1、2∶1、1∶1和1∶2的比例組合存在時(shí),均具有DPPH自由基清除能力。各組產(chǎn)品對(duì)DPPH自由基的清除效果隨著濃度增加而增大。在同一水平濃度下,葉黃素與玉米黃質(zhì)混合組的清除效果優(yōu)于其單一產(chǎn)品的清除效果。綜合不同比例及不同濃度的清除效果,葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品以1∶2比例存在時(shí),其DPPH·清除效果最佳,1∶1次之,2∶1較差。

2.2對(duì)鐵離子還原能力比較

葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品協(xié)同對(duì)鐵離子還原能力的結(jié)果如表3所示。

從表3中可看出,當(dāng)葉黃素與玉米黃質(zhì)以不同比例混合時(shí),均具有對(duì)鐵離子還原的能力。各組產(chǎn)品對(duì)鐵離子還原能力隨濃度增加而增大,且混合組對(duì)鐵離子還原能力優(yōu)于其以單一產(chǎn)品。綜合不同比例及不同濃度樣品對(duì)鐵離子還原效果,葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品以1∶1比例存在時(shí)對(duì)鐵離子還原能力最佳,1∶2次之,4∶1和5∶1較差。

2.3對(duì)氧自由基吸收能力的比較

葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品協(xié)同對(duì)氧自由基吸收能力的結(jié)果如表4所示。

從表4中可看出,單一產(chǎn)品葉黃素與玉米黃質(zhì)以及混合產(chǎn)品均具有較強(qiáng)的氧自由基吸收能力,但玉米黃質(zhì)的氧自由基吸收能力明顯高于葉黃素產(chǎn)品(p<0.05)。各混合比例組中,1∶2、4∶1與5∶1組的效果顯著優(yōu)于葉黃素產(chǎn)品(p<0.05),而這三組與玉米黃質(zhì)相比,僅有1∶2組的效果具有顯著性差異(p<0.05)。綜合比較,葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品以1∶2比例組合時(shí),其ORAC值較高;而1∶1和2∶1組合的效果相對(duì)較差。

綜合以上葉黃素與玉米黃質(zhì)體外抗氧化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選用協(xié)同效果較好的1∶2組合,以及協(xié)同效果較差的2∶1組合進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

2.4葉黃素和玉米黃質(zhì)對(duì)ICR小鼠血清抗氧化水平的影響

葉黃素和玉米黃質(zhì)對(duì)小鼠血清中各指標(biāo)的影響見表5。

表5 各組產(chǎn)品對(duì)小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px和MDA的影響Table 5 Effects of different carotenoids group on SOD、GSH、GSH-Px and MDA in mice serum(±S,n=10)

注:與空白對(duì)照組相比,a為差異顯著(p<0.05),b為差異極顯著(p<0.01);與模型對(duì)照組相比,A為差異顯著(p<0.05),B為差異極顯著(p<0.01)。表6同。

表6 各組產(chǎn)品對(duì)小鼠肝組織SOD、GSH、GSH-Px、MDA和PCO的影響Table 6 Effects of different groups on SOD、GSH、GSH-Px、MDA and PCO in mice liver tissue(±S,n=10)

從表5可看出,給予實(shí)驗(yàn)劑量(50%乙醇12 mL/kg·BW)乙醇造模,模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,小鼠血清SOD和GSH-Px活性下降且差異極顯著(p<0.01),GSH含量降低、MDA含量升高且差異極顯著(p<0.01),由此說(shuō)明乙醇氧化損傷模型造模成功。與模型組相比,各實(shí)驗(yàn)組均能顯著降低小鼠血清MDA含量(p<0.01),增加GSH水平(p<0.01),同時(shí)還能增加小鼠體內(nèi)的GSH-Px酶活(p<0.01)和SOD酶活(p<0.01),說(shuō)明葉黃素、玉米黃質(zhì)以及葉黃素與玉米黃質(zhì)混合樣品對(duì)乙醇氧化損傷ICR小鼠有較好的抗氧化作用。在葉黃素與玉米黃質(zhì)混合組中,葉黃素/玉米黃質(zhì)(1∶2)組顯示出比葉黃素/玉米黃質(zhì)(2∶1)更優(yōu)越的抗氧化性能。

2.5葉黃素與玉米黃質(zhì)產(chǎn)品對(duì)ICR小鼠肝臟抗氧化水平的影響

各組產(chǎn)品對(duì)ICR小鼠肝臟抗氧化水平的影響,如表6所示。

給予實(shí)驗(yàn)劑量(50%乙醇12 mL/kg·BW)乙醇造模,模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織SOD和GSH-Px活性下降且差異極顯著(p<0.01),GSH含量降低且差異顯著(p<0.05),MDA和蛋白質(zhì)羰基含量升高且差異極顯著(p<0.01)。與模型組相比,各實(shí)驗(yàn)組均能降低小鼠組織MDA和PCO含量(p<0.01),增加GSH水平(p<0.01),同時(shí)還能夠增加小鼠體內(nèi)的GSH-Px酶活(p<0.05)和SOD酶活(p<0.01),表現(xiàn)出較好的體內(nèi)抗氧化活性。在葉黃素與玉米黃質(zhì)混合組中,葉黃素/玉米黃質(zhì)1∶2組的抗氧化效果較好,優(yōu)于單一形式存在的產(chǎn)品以及葉黃素/玉米黃質(zhì)2∶1組,這與之前的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

視網(wǎng)膜內(nèi)除含有很多對(duì)光敏感的化合物外,還含有如DHA等的易氧化底物。視網(wǎng)膜上的光敏物質(zhì)在有光照刺激的情況下會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng),生成對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有毒性的物質(zhì),而該物質(zhì)是老年性黃斑變性發(fā)生的主要因素之一。另外,視網(wǎng)膜內(nèi)還分布著大量的毛細(xì)血管,這使得其氧濃度很高。晶狀體聚焦可產(chǎn)生高強(qiáng)度、高能量的光線,而光線很容易在視網(wǎng)膜中誘發(fā)能與含雙鍵分子(如DHA)發(fā)生反應(yīng)的單線態(tài)氧自由基,二者發(fā)生后會(huì)進(jìn)一步引發(fā)能使視網(wǎng)膜受到氧化損傷的脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[20-21]。葉黃素和玉米黃質(zhì)是視網(wǎng)膜黃斑的組成成分[22]。

葉黃素與玉米黃質(zhì)在結(jié)構(gòu)上互為同分異構(gòu)體,差別僅為其中一個(gè)紫羅酮環(huán)的雙鍵位置不同。葉黃素的這個(gè)雙鍵形成烯丙基羥基末端,而玉米黃質(zhì)中相應(yīng)的雙鍵則與相鄰直鏈雙鍵形成共軛體系。在抗氧化活性方面,兩者在不同的抗氧化指標(biāo)中效果有所不同,這可能與兩者的活性基團(tuán)及雙鍵位置在氧化過(guò)程中所起到的作用不同有關(guān)。不同比例進(jìn)行混合后,仍然呈現(xiàn)出不同的抗氧化效果,說(shuō)明葉黃素與玉米黃質(zhì)的抗氧化協(xié)同作用與其配比關(guān)系較大。本文研究了葉黃素與玉米黃質(zhì)不同比例混合樣品的體內(nèi)外抗氧化效果。研究發(fā)現(xiàn):葉黃素與玉米黃質(zhì)以1∶2比例能發(fā)揮較好的協(xié)同抗氧化作用,對(duì)DPPH自由基的清除能力、鐵離子還原能力及氧自由基吸收能力較高。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,葉黃素/玉米黃質(zhì)1∶2組體現(xiàn)出較好的抗氧化效果。該項(xiàng)研究結(jié)果為日后更進(jìn)一步深入研究葉黃素與玉米黃質(zhì)對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用具有重要意義。

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Studyonthesynergisticantioxidantactivityofluteinandzeaxanthin

RENDan-dan1,2,ZHANGHai-li1,WANGXi-tong1,XUELing-yun2,WUWen-zhong2

(1.College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2. Dalian Innobioactives Company Limited,Dalian 116600,China)

Lutein and zeaxanthin are major carotenoids in human eyes. They have very good effects to prevent eye disease. In this paper,antioxidant activity of lutein and zeaxanthininvivoandinvitrowere discussed,which provided a theoretical basis for the development of composite carotenoids products. Antioxidant activities of lutein and zeaxanthininvitrowere measured by methods including DPPH radical scavenging system,FRAP and ORAC. Synergistic antioxidant activities of lutein and zeaxanthininvivowere studied by the establishment of ethanol oxidation damage model using ICR mice. The results showed that the ratio of lutein and zeaxanthin 1∶2 had excellent antioxidant effectinvitro,while 2∶1 had poor effect. Group of lutein/zeaxanthin 1∶2 showed stronger antioxidant activitiesinvivo.

lutein;zeaxanthin;synergistic antioxidant

2017-02-20

任丹丹(1980-),女,博士,副教授,研究方向:海洋生物資源利用,E-mail:rdd80@163.com。

大連市企業(yè)博士后研究人員資助項(xiàng)目。

TS254.2

:A

:1002-0306(2017)17-0296-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.058