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(北京工商大學計算機與信息工程學院,食品安全大數(shù)據(jù)技術北京市重點實驗室，北京100048)

菠菜表面農(nóng)殘的SERS無損檢測方法研究

劉翠玲,邢瑞芯*,孫曉榮,趙琦

(北京工商大學計算機與信息工程學院,食品安全大數(shù)據(jù)技術北京市重點實驗室，北京100048)

本文針對菠菜農(nóng)藥殘留量超標問題,建立了一種能夠快速、無損地對菠菜表面農(nóng)藥殘留量進行檢測的方法。利用表面增強拉曼光譜技術(SERS,Surface Enhanced Raman Scattering)采集含農(nóng)藥(溴氰菊酯)和不含的兩組菠菜樣本的SERS光譜,結合一階導加Norris求導法、Savitzky-Golay卷積求導法進行光譜預處理,使用判別分析法和距離匹配法建立定性分析模型,成功區(qū)分兩組菠菜樣本,模型預測準確率最高可達到100%;使用偏最小二乘法建立了菠菜表面溴氰菊酯殘留量的多個定量分析模型,研究發(fā)現(xiàn)差譜模型效果最好,其校正集相關系數(shù)(Rc)和預測集相關系數(shù)(Rp)分別為0.9908,0.9552,校正均方根誤差(RMSEC)和預測均方根誤差(RMSEP)分別為0.0802,0.23。結果表明,運用SERS方法能夠很好地實現(xiàn)菠菜表面溴氰菊酯殘留量的無損定性和定量檢測分析,且無需任何前處理,對其它農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的快速、無損檢測具有借鑒意義。

SERS,無損檢測,菠菜,溴氰菊酯

我國是世界果蔬生產(chǎn)和消費大國,每年出口總量一直穩(wěn)居世界前列。菠菜作為常見葉菜的一種,備受人們喜愛。但在近年來中國的蔬菜出口貿(mào)易中,菠菜屢屢被拒的問題引起社會廣泛關注,其主要原因是農(nóng)藥殘留量超標。特別是出口日本冷凍菠菜中毒死蜱超標事件[1-3],使得研究一種快速、無損的菠菜中農(nóng)藥殘留量檢測的方法成為必要。眾所周知,蔬菜生長過程中易發(fā)病害較多,會嚴重影響菠菜長勢、產(chǎn)量與質量。為此,不少菜農(nóng)大量使用農(nóng)藥進行高溫噴灑滅殺害蟲或去除病害,甚至有部分菜農(nóng)在安全間隔期內(nèi)就收獲菠菜上市。這些利益所趨的做法均導致菠菜中農(nóng)藥殘留量超標現(xiàn)象產(chǎn)生。因此,研究菠菜中農(nóng)藥殘留量的快速、無損檢測,對于食品質量安全和我國的蔬菜經(jīng)濟發(fā)展十分重要。

表1 溴氰菊酯物化信息表Table 1 Physical chemistry information of deltamethrin

傳統(tǒng)的果蔬中農(nóng)藥殘留量的檢測主要依靠理化檢測方法,包括色譜法、色譜-質譜聯(lián)用法以及直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法等經(jīng)典化學方法[4-6],但這些方法存在前處理復雜,耗時耗力,不利于及時監(jiān)測等缺陷。各種現(xiàn)代光譜分析檢測技術的出現(xiàn)為我們提供了一種新的解決思路。尤其是近幾年來迅速發(fā)展的表面增強拉曼光譜(SERS)技術,它作為拉曼光譜技術的一種,由于所需樣本濃度低、靈敏度高等特點,在食品與農(nóng)產(chǎn)品安全檢測方面得到越來越多的重視[7]。目前已有學者利用SERS技術對大白菜汁中馬拉硫磷[8]、橘子汁中毒死蜱[9]、蘋果汁中亞胺硫磷[10]殘留量進行檢測,并取得較好的結果。但這些研究多是對果蔬的碎片或汁液進行檢測,必須對果蔬本身造成一定程度的破壞,剝奪了果蔬的食用價值,造成浪費。因此,我們旨在探索一種直接對完整果蔬進行無損檢測的方法,即確保果蔬食用性能不受影響和損害的前提下,對其指標快速檢測,提高果蔬產(chǎn)品的安全性。目前,鮮有報道利用SERS技術對完整菠菜實現(xiàn)無損檢測[11]。因此,如何利用SERS技術實現(xiàn)果蔬的無損檢測仍值得我們探索與研究。

針對以上問題,本研究選擇完整菠菜為基底,采集無溴氰菊酯及含溴氰菊酯的菠菜的SERS光譜,嘗試對其表面溴氰菊酯殘留量進行快速、無損檢測。其中,溴氰菊酯是菠菜中常用的一種殺蟲劑,對于蔬菜和果樹等害蟲的防治十分有效[12]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菠菜 市售,葉片大小、顏色均勻一致;溴氰菊酯農(nóng)藥:乳油制劑,有效成分含量為25 g/L 購自德國拜耳作物科學(中國)有限公司,生產(chǎn)日期2016/3/2,詳細物化信息見表1;表面增強劑:Easy Peak(舒峰TM)科研型2號銀溶膠 購自上海納騰儀器有限公司。

DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn),有效探測范圍是0～3500 cm-1,實驗前用聚乙烯對拉曼光譜儀進行峰位校準。

1.2溶液配制

依據(jù)國標GB 2763-2014食品中農(nóng)藥殘留最大殘留限量的規(guī)定,菠菜中溴氰菊酯含量不得超過0.5 mg/kg,因此實驗實施方案如下:

配制不同濃度的溴氰菊酯標準溶液15個,以去離子水為溶劑,25 g/L溴氰菊酯乳油為溶質,質量分數(shù)在0.05～2 mg/kg之間分布。選取15片形狀、大小、顏色基本一致的新鮮菠菜葉片,用去離子水洗凈后,置于常溫下自然干燥。為去除葉片差異,做一組平行樣本。共計30個樣本。

為確保實驗可行性,首先進行了SERS技術檢測溴氰菊酯水溶液可行性的預實驗。配制濃度為100 mg/L的溴氰菊酯標準母液,并依次將母液稀釋為10,5,1,0.5,0.1,0.1,0.05 mg/L的標準溶液。

1.3光譜采集

實驗發(fā)現(xiàn),由于濃度較低,無法觀測到溴氰菊酯溶液的拉曼信號。后期加入表面增強劑(按溴氰菊酯溶液與增強劑1∶1的體積比混合),采集其SERS光譜;同時為排除溶液中水、增強劑的干擾,分別采集各自的SERS光譜。三者的光譜如圖1中所示,水、表面增強劑的SERS信號基本為零,排除水、增強劑的檢測干擾,溴氰菊酯溶液的SERS信號十分顯著,在227,2935 cm-1處拉曼強度明顯,且400～1700 cm-1之間存在眾多低峰,這為該研究提供可能。

圖1 水、增強劑和溴氰菊酯標準溶液的SERS光譜Fig.1 SERS of water,enhancer and deltamethrin standard solutions

本實驗選取顏色均勻的新鮮菠菜樣本30個,每15個為一組,將所有樣本分為2組。首先,使用移液槍往所有樣本表面滴加一定量的表面增強劑,依次放在包裹錫紙的載玻片上、對增強劑部位進行面掃描;其次,取1.2中的溴氰菊酯標準溶液滴加于樣本的增強劑部位,自然晾干后進行面掃描。實驗最終得到含或不含溴氰菊酯的菠菜樣本面掃描譜圖共計60張。

其中,實驗儀器的各項參數(shù)設置為:奧林巴斯BX51研究級顯微鏡,10X目鏡聚焦,激光波長780 nm,激光能量24 mW,光柵400 lines/mm,光闌50,估計分辨率4.7～8.7 cm-1,采集曝光時間5 s,選擇熒光修正。面掃描步長50 μm×50 μm,點數(shù)2×2。

1.4預處理及建模方法

適當預處理與建模方法結合,能夠進一步提取有效光譜信息,得到更好的模型結果。

導數(shù)是光譜領域常用的預處理方法之一,常見的有:直接差分法、Norris求導法和Savitzky-Golay卷積求導法,它們各有各的特點。直接差分法可有效地消除基線和其他背景的干擾,提高分辨率和靈敏度,但同時可能會導致信噪比下降[10];Norris求導法能夠在求導前對原始光譜進行平滑去噪,在提取特征峰的同時也能夠消除光譜變換帶來的噪聲影響;Savitzky-Golay卷積求導法是目前應用較廣泛的去噪方法,盡可能減小平滑對有效信息的影響[13]。

本研究使用的預處理如下:選取3～4個特征波段,并采用Norris求導法、Savitzky-Golay卷積求導法,或分別與一階求導結合的多種處理方法,旨在提高分辨率和提取特征峰的同時,盡可能減小光譜變換帶來的噪聲影響。

建立模型時,本研究使用判別分析(Discriminant Analysis,DA)和距離匹配(Distance Match,DM)兩種常見的分類算法[14],建立無或含溴氰菊酯的兩組菠菜樣本定性分析模型。定量模型則采用經(jīng)典的偏最小二乘算法,分別建立菠菜表面溴氰菊酯的原始光譜及其差譜模型。差譜是指用含溴氰菊酯的菠菜SERS光譜減去無溴氰菊酯的菠菜SERS光譜,得到光譜即為差譜。此操作理論上可以消除菠菜基底影響,得到近似溴氰菊酯水溶液的SERS光譜[15-16]。

2 結果與分析

2.1基本處理

本實驗儀器采集得到的原始光譜是樣本的面掃描譜圖,每張譜圖由固定區(qū)域內(nèi)的4個點光譜組成。因此,首先將面掃描譜圖進行基本處理,即拆分成4張點光譜圖,并求算數(shù)平均獲得平均譜圖。隨后手動剔除4個光譜差異較大的奇異樣本,剩余有效樣本56個。此外,由于有效樣本光譜也存在漂移嚴重的現(xiàn)象,選擇線性擬合方法進行基線校正。校正后的無溴氰菊酯及含溴氰菊酯的菠菜的SERS光譜分別如圖2a、圖2b所示。

圖2 基線校正后的光譜Fig.2 Spectra after baseline

圖2a中,700～1700 cm-1波段為菠菜拉曼峰的主要集中區(qū)域。其中,1157 cm-1和1527 cm-1處有兩個比較明顯的波峰,有文獻記載是由菠菜中葉綠素外琳環(huán)的C-O-C和C=C雙鍵振動所引起的;745,1186、1327 cm-1處存在眾多低峰,可能與菠菜中的維生素、固形物含量等成分有關[17]。但兩張圖表現(xiàn)出較大的相似性,特征峰位差異較小,不易分辨。

這是由于在SERS光譜采集過程中,由于菠菜樣本基底復雜,容易產(chǎn)生很強的熒光背景,因而使有效信號變差甚至被淹沒;此外,樣本濃度配制較低,導致所呈現(xiàn)的光譜信噪比不高,無法完整的反映物質本身的性質、結構。因此需選擇適當?shù)念A處理方法對光譜進行處理,進一步提取有效光譜信息,以得到更好的建模數(shù)據(jù)與結果。

2.2定性分析

使用Norris 5點求導后的光譜,建立判別分析和距離匹配模型,對無溴氰菊酯及含溴氰菊酯的兩組菠菜樣本做定性分析。在圖3a判別分析模型中,橫坐標為樣本距含溴氰菊酯的菠菜類別(記為類別2)的馬氏距離,縱坐標為樣本距無溴氰菊酯的菠菜類別(記為類別1)的馬氏距離,圖中的直線為距離橫縱坐標距離相等點的直線。建模結果顯示,樣本的大多數(shù)都能劃分正確,但受菠菜基底復雜和樣本濃度過低影響,有4個建模集樣本出現(xiàn)了分類錯誤。隨后隨機選擇校驗集樣本9個作為測試樣本,均劃分正確。但為進一步驗證,采用距離匹配方法建立模型。

圖3b為距離匹配模型,橫坐標為樣本距類別1的馬氏距離,縱坐標為樣本距類別2的馬氏距離,隨機挑選12個樣本對模型進行測試,所有樣本都比較準確地被劃分到自身所屬類別當中,定性準確率達到100%。

由于兩個模型中校驗集樣本存在濃度相同及相近的情況,只標出了若干校驗集樣本,為更清楚的說明預測結果,模型的具體預測結果如表2、表3所示。其中,類別1為無農(nóng)藥菠菜樣本,類別2為含溴氰菊酯菠菜樣本?？梢钥吹?兩組預測樣本都被正確分類,預測正確率為100%。

圖4 定量模型擬合曲線Fig.4 Quantitative analysis models 注:(a)模型1,(b)模型2,(c)模型3擬合曲線圖,(d)模型3殘差圖，具體模型見表5。

序號距純凈菠菜的距離距含DM菠菜的距離實際類別預測類別10.23570.72031120.33360.84821130.41570.83391140.19720.78521150.5730.88411170.87060.40392281.28960.71162291.52271.069622

表3 距離匹配定性識別結果Table 3 Distance match result

從定性結果來看,采用SERS技術結合距離匹配、判別分析方法來研究菠菜表面溴氰菊酯殘留均能得到較好的定性結果,但距離匹配模型的結果要更好一些。

2.3定量分析

定性分析很好地區(qū)分了無溴氰菊酯和含溴氰菊酯的兩組菠菜樣本,為準確預測菠菜表面溴氰菊酯的具體含量提供可能。在定量分析中,采用經(jīng)典的偏最小二乘算法(PLS)結合多種預處理方法,分別建立了菠菜表面溴氰菊酯的原始光譜及其差譜模型。部分模型結果見圖4。對比發(fā)現(xiàn),差譜模型結果明顯優(yōu)于原始光譜,其校正集相關系數(shù)可達到0.99以上,隨機挑選了5個樣本作為測試集后的相關系數(shù)也可達到0.95以上。

圖4c、圖4d所示為模型3的擬合曲線和殘差圖,箭頭所指的為本次實驗的5個測試樣本?？梢钥吹?基于差譜法的菠菜表面溴氰菊酯樣本定量分析模型的擬合效果較好,最佳因子數(shù)為6,校正結果的相關系數(shù)均可達到0.99以上,預測結果的相關系數(shù)也可達到0.95以上,模型RMSEC和RMSEP也均在可接受范圍內(nèi)。殘差圖中,預觀值相對于真實值都有一定的偏差,但除個別樣本外,其余測試樣本的殘差比均在50%以下,同樣可以滿足農(nóng)藥制劑市場的要求。具體預測結果見表4所示。

表5為不同預處理方法下的部分定量模型對比?？梢?選擇3個特征波段、采用一階導數(shù)加Savitzky-Golay求導建立的PLS定量模型結果最好,其各項模型評價指標都明顯優(yōu)于其他模型。

表5 部分定量模型對比Table 5 Different quantitative models

表4 測試結果Table 4 Test result

3 結論

本研究采用表面增強拉曼光譜技術,得到了一種能夠快速、無損的對菠菜表面溴氰菊酯殘留量進行檢測的方法,具有較為重要的實際意義。其中,定性分析成功區(qū)分含農(nóng)藥(溴氰菊酯)與不含的兩組菠菜樣本,基于距離匹配算法的定型模型預測準確率高達100%;采用差譜建立的偏最小二乘定量模型較好地消除了菠菜基底干擾,準確預測了菠菜表面溴氰菊酯的具體含量,模型校正集相關系數(shù)(Rc)和預測集相關系數(shù)(Rp)分別為0.9908,0.9552,校正均方根誤差(RMSEC)和預測均方根誤差(RMSEP)分別為0.0802,0.23。結果表明,該研究方法具有較高的實用價值,今后也可推廣到其他果蔬農(nóng)藥殘留量的無損檢測中去。不過,此次實驗樣本數(shù)量較少,為了提高模型穩(wěn)定性和精確度,后期將增加樣本數(shù)量,進一步擴充和完善實驗。

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ResearchonnondestructivedetectionofpesticideresidueinspinachbySERS

LIUCui-ling,XINGRui-xin*,SUNXiao-rong,ZHAOQi

(School of Computer and Information Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing Key Laboratory of Big Data Technology for Food Safety,Beijing 100048,China)

A method for rapid and nondestructive detection of pesticide residues on spinach surface by using surface enhanced raman scattering(SERS)was built in this paper. SERS of spinach samples with and without deltamethrin were pretreated with some methods such as first derivation,Norris derivation and Savitsky-Golay convolution derivation. Discriminant analysis and distance match method were used to build qualitative model for determination of spinach samples with and without deltamethrin,and the highest accuracy rate of prediction was proved to be 100%. Then several quantitative models of those samples contained deltamethrin pesticide were built with partial least squares(PLS). The results showed that the best model was built with the differential spectrum. The correlation coefficient of calibration(Rc)and the correlation coefficient of validation(Rp)of the best model were 0.9908,0.9552 respectively. The root mean square error RMSEC and the root mean square error RMSECV were 0.0802,0.23 respectively. All results indicated that this method can be used for a rapid and nondestructive detection of deltamethrin on spinach,as well as other agricultural products.

SERS;nondestructive detection;spinach;deltamethrin

2017-02-07

劉翠玲(1963-)，女，博士，教授，研究方向：智能測量技術與數(shù)據(jù)處理、系統(tǒng)建模與仿真方法研究、智能控制方法，E-mail：liucl@btbu.edu.cn。

*通訊作者:邢瑞芯(1993-)，女，碩士，研究方向：光譜檢測技術與信息處理，E-mail:xing19930528@126.com。

北京市自然科學基金項目(4142012)。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)17-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.047