馬超+胡明廣+金波

[摘要]目的 探討封閉式薄片法對梗阻性無精子癥（OA）患者睪丸單精子的冷凍效果，以期為非梗阻性無精子癥（NOA）患者單精子冷凍保存提供一種簡單有效的方式。方法 選取2016年6～12月在大連市生殖與遺傳醫(yī)學(xué)中心診斷為OA 15例患者作為研究對象，應(yīng)用封閉式薄片法冷凍方式對睪丸單精子進(jìn)行冷凍保存。睪丸冷凍精子解凍復(fù)蘇后（冷凍組），對體外成熟（IVM）卵子行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI），統(tǒng)計其受精率與卵裂率，并與睪丸新鮮精子（新鮮組）ICSI進(jìn)行比較，以期對睪丸單精子解凍后受精能力進(jìn)行評估。冷凍組及新鮮組精子均來自上述15例患者。結(jié)果 應(yīng)用封閉式薄片法對睪丸單精子進(jìn)行冷凍，解凍后具有很高的精子回收率與存活率（92.00%，65.94%）。冷凍組與新鮮組具有相似的受精率（56.00% vs. 70.66%）和卵裂率（97.44% vs. 95.83%），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 封閉式薄片法玻璃化冷凍方式可有效保存OA患者睪丸單精子，且精子復(fù)蘇后具有較高的受精能力，為NOA患者單精子冷凍保存應(yīng)用于臨床奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]睪丸單精子；冷凍保存；無精子癥；回收率

[中圖分類號] R321.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）08（c）-0019-04

[Abstract]Objective To investigate the effect of Closed-Sheet Method on testicular spermatozoa in patients with obstructive azoospermia（OA），in order to provide a simple and effective cryopreservation for individual numbers of testicular spermatozoa in patients with non-obstructive azoospermia（NOA）.Methods 15 patients were diagnosed with OA by Reproductive Medicine & Genetic Center of Dalian from June to December 2016.Single testicular spermatozoa was frozen with Closed-Sheet Method，and we compared cleavage rate and fertility rate after ICSI between frozen-thawed individual numbers of testicular spermatozoa and fresh testicular sperm with abandoned in vitro maturation of immature oocytes，and the fertilization rate of frozen-thawed testicular spermatozoa was evaluated.Both frozen and fresh groups were from the above 15 patients.Results The frozen-thawed individual numbers of testicular spermatozoa had higher recovery rate and viability rate（92.00%，65.94%） with the Closed-Sheet Method.The fertility rate （56.00% vs 70.66%）and cleavage rate （97.44% vs 95.83%） of frozen testicular spermatozoa was similar to fresh testicular sperm after ICSI，and no significant difference（P>0.05）.Conclusion Since the frozen-thawed testicular spermatozoa had a higher ability of fertilization.The Closed-Sheet Method was effective to cryopreserve individual numbers of testicular spermatozoa in patients with OA.This study laid the experimental basis for the clinical application of single sperm cryopreservation in patients with NOA.

[Key words]Individual numbers testicular spermatozoa；Cryopreservation；Azoospermia；Recovery rate

隨著Bung等[1]1953年成功對人類精子進(jìn)行冷凍保存，精子冷凍技術(shù)在當(dāng)今發(fā)展已趨于成熟，可作為不孕不育患者的一種常規(guī)輔助生育手段。然而對于無精子癥患者睪丸精子的冷凍保存，尤其是對非梗阻性無精子癥（nonobstructive azoospermia，NOA）患者來說，采用常規(guī)精液冷凍保存技術(shù)往往不能達(dá)到滿意的效果[2]。為了避免取卵日因睪丸取精失敗而取消周期，同時避免反復(fù)睪丸活檢對睪丸功能的損傷，對睪丸微量精子甚至單精子進(jìn)行冷凍保存具有重要意義。在筆者以往的研究中，應(yīng)用封閉式薄片法對正常精液標(biāo)本微量精子進(jìn)行冷凍并取得成功[3]。本研究進(jìn)一步將此方法運(yùn)用到OA患者睪丸單精子的冷凍保存中，觀察解凍后精子的相關(guān)指標(biāo)以及受精能力，以期為NOA患者單精子冷凍保存應(yīng)用臨床打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。endprint

1資料與方法

1.1研究對象

選取2016年6～12月在本中心男科門診接受睪丸活檢的15例OA患者作為研究對象，活檢后剩余精子作為研究標(biāo)本。其中2例有睪丸炎病史，其余均為原因不明的無精子癥。OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)為3次射出精液離心沉淀后未見到精子，經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)（testicular spermextraction，TESA）后，均可見精子。所有患者染色體檢查均為46，XY（3例小Y，1例大Y），性激素測定均在正常范圍之內(nèi)。體外成熟（in vitro maturation，IVM）卵子來源于同期卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI）周期。本研究經(jīng)大連市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 TESA精子獲取 若采卵日（ICSI）周期獲取未成熟卵子較多（大于10枚），告知男科醫(yī)師次日上午行TESA活檢術(shù)，活檢標(biāo)本（新鮮組）部分直接用與IVM卵子ICSI；部分冷凍保存，日后解凍（冷凍組）用于IVM卵子ICSI?；顧z具體步驟如下：常規(guī)皮膚消毒，用5 ml注射器吸入少量培養(yǎng)液后經(jīng)陰囊皮膚穿刺刺入睪丸，抽吸針管獲得少許睪丸組織，將睪丸組織送實(shí)驗(yàn)室檢查，解剖顯微鏡下用1 ml注射器撕碎分開生精小管，G-MOPS-plus（Vitrolife）中清洗2遍，盡量多地去除紅細(xì)胞，然后用吸管反復(fù)吹打混勻，吸入離心管，混懸液1000 r/min離心5 min，留取沉淀，培養(yǎng)箱中孵育后備用。

1.2.2冷凍載體的制備 冷凍載體是由手工裁剪聚丙烯薄片和常規(guī)精子冷凍管組成。具體構(gòu)造見文獻(xiàn)[3]。

1.2.3睪丸精子冷凍及復(fù)蘇 ①冷凍前準(zhǔn)備：注射皿（BD FALCON 1006）中做好50 μl長條液滴，礦物油覆蓋，巴斯特吸管吸取約5 μl的離心后沉淀，加入液滴下端，置于37℃預(yù)溫5 min。②冷凍過程：使用顯微操作系統(tǒng)（RI-Integra Ti）從精子微液滴中吸取10根活力較好精子，冷凍薄片置于100 mm皿（BD FALCON 3003）中，用移液槍將1.0 μl含10%人血清清蛋白的HEPES緩沖液加在冷凍薄片前段，同時快速將注射針落入冷凍微滴中，并將吸入精子注入微液滴中，立即用無菌鑷子將冷凍薄片夾入精子冷凍管中，旋緊螺帽，液氮上方1 cm熏蒸2 min，隨即投入液氮中保存。③復(fù)蘇前準(zhǔn)備：將3 ml礦物油倒入培養(yǎng)皿中（BD FALCON 3001），置于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫備用。④復(fù)蘇過程：將精子冷凍管從液氮中取出，旋開螺帽，用鑷子將冷凍薄片夾出，迅速浸入37℃礦物油中復(fù)蘇。37℃培養(yǎng)箱中孵育5 min，隨即可對復(fù)蘇后精子進(jìn)行評估。

1.2.4精子復(fù)蘇后相關(guān)指標(biāo)評估 解凍復(fù)蘇后對精子回收率、活動率及存活率進(jìn)行評估。具體評估方式如下：精子回收率=回收精子數(shù)/冷凍精子數(shù)；精子活動率=（前向運(yùn)動精子數(shù)+非前向運(yùn)動精子數(shù)）/回收精子數(shù)；精子存活率（低滲腫脹實(shí)驗(yàn)）=尾部卷曲精子數(shù)/回收精子數(shù)。

1.2.5超促排卵及卵子的獲取 超促排卵采用超長方案、長方案和短方案[4]，當(dāng)有≥2個優(yōu)勢卵泡直徑20 mm時，注射絨毛膜促性腺激素（HCG）10 000 IU，36 h后行陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。

1.2.6 IVM卵子收集、受精及卵裂情況 對采卵首日ICSI周期獲取卵子行剝除顆粒細(xì)胞后，一旦發(fā)現(xiàn)MI期或GV期卵子，轉(zhuǎn)移至G-IVF-plus（Vitrolife）培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，次日上午觀察極體排出情況，若發(fā)現(xiàn)第一極體排出，則可用于ICSI。冷凍組精子選擇：解凍后挑選形態(tài)正?；顒踊虿粍泳有蠭CSI，不動精子經(jīng)低滲腫脹實(shí)驗(yàn)后，選取尾部卷曲精子行ICSI。新鮮組精子選擇：挑選形態(tài)正?；顒泳有蠭CSI。ICSI具體步驟按本中心常規(guī)操作。ICSI后16～18 h觀察受精情況，正常受精標(biāo)準(zhǔn)為雙原核（2PN）出現(xiàn)。ICSI后40～42 h觀察卵裂情況，2細(xì)胞以上視為發(fā)生卵裂。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1睪丸單精子冷凍復(fù)蘇后相關(guān)指標(biāo)

15例患者TESA后均見活動精子，睪丸單精子冷凍解凍后回收率、活動率與存活率分別為92.00%（138/150）、16.67%（23/138）、65.94%（91/138）。

2.2兩組ICSI結(jié)果的比較

兩組受精率、2PN率和卵裂率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

3討論

ICSI技術(shù)結(jié)合顯微外科取精術(shù)解決了大多數(shù)男性無精子癥患者的生育問題，但對NOA患者來說，首次手術(shù)取精成功后，再次取精仍然有30%失敗風(fēng)險[5]，因此對第一次活檢找到的微量睪丸精子進(jìn)行冷凍保存，顯得十分必要。雖然人類精子冷凍技術(shù)在1953年經(jīng)Bung等[1]研究獲得成功，并已經(jīng)在輔助生殖技術(shù)中常規(guī)開展，但對來自NOA患者的睪丸精子，因?yàn)楂@取數(shù)量少，精子活力低，且精子成熟度差等原因，常規(guī)精液冷凍保存技術(shù)往往無法達(dá)到凍存要求。因此，找到一種合適的冷凍方法對微量精子甚至是單精子進(jìn)行冷凍保存，已經(jīng)成為輔助生殖技術(shù)中的一個函待解決的問題。

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展與完善，人們逐漸認(rèn)識到可通過玻璃化冷凍方式對精子進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇[6-9]。現(xiàn)有研究資料顯示，國內(nèi)外研究者采用空透明帶冷凍法[10]、冷凍環(huán)法[11]、微麥管法[12]、ICSI針法[13]、冷凍薄膜及Cell sleeper法[7]，極體活檢針法[14]等方式對微量精子進(jìn)行冷凍保存。根據(jù)冷凍方法不同，精子復(fù)蘇后回收率可達(dá)59%～100%，存活率可達(dá)8%～85%[14]。但上述方法由于可操作性差和儲存安全性低等原因，很難常規(guī)在臨床上開展應(yīng)用。我們過去嘗試應(yīng)用封閉式薄片法對正常精液標(biāo)本單精子進(jìn)行冷凍并取得成功[3]，大大改善了冷凍可操作性和儲存安全性，并獲得了較高的精子回收率與存活率。同時比較了冷凍保護(hù)劑與無冷凍保護(hù)劑對微量精子的冷凍效果，結(jié)果顯示，二者具有相似的冷凍效果。本研究進(jìn)一步將此方法運(yùn)用到睪丸單精子的冷凍保存中，采用無冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍的方式，同樣獲得了較高的精子回收率和存活率。endprint

值得注意的是，睪丸精子解凍復(fù)蘇后活動率極低，基本無前向運(yùn)動精子，活動精子均表現(xiàn)為尾巴偶爾輕輕擺動，需在鏡下仔細(xì)長時間觀察方可發(fā)現(xiàn)。究其原因，首先由于睪丸精子未經(jīng)過在附睪的進(jìn)一步成熟過程，精子細(xì)胞膜尚未完全成熟，抗凍能力較差。其次，通過TESA獲得的睪丸組織混有少量血細(xì)胞和大量死亡精子碎片等雜質(zhì)，且睪丸精子缺少精漿的保護(hù)，導(dǎo)致其易造成冷凍損傷，解凍后活動能力下降。

近來國內(nèi)外文獻(xiàn)報道傳統(tǒng)方式冷凍睪丸精子解凍后行ICSI能取得與新鮮睪丸精子相似的受精率及臨床妊娠率[15-16]。但國內(nèi)外對睪丸單精子冷凍解凍后ICSI結(jié)局報道較少，Walmesly等[10]和Endo等[7]成功對睪丸單精子進(jìn)行冷凍保存，并獲得了較高的受精率與卵裂率。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用封閉式薄片法冷凍睪丸單精子，精子解凍后仍然具有較高的受精能力，與睪丸新鮮組比較后發(fā)現(xiàn)，冷凍組受精率雖然低于新鮮組，但兩組受精率和卵裂率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國外報道基本一致。

此外，由于睪丸單精子冷凍復(fù)蘇后多數(shù)為不動精子，如何選擇不動精子行ICSI對臨床結(jié)局尤為重要。應(yīng)用睪丸不動精子行ICSI的臨床應(yīng)用國內(nèi)外均有報道[7，17-18]，本研究通過選擇正常形態(tài)的活動精子直接行ICSI，或不動精子經(jīng)低滲腫脹實(shí)驗(yàn)后選取尾部卷曲精子行ICSI的方式對IVM卵子進(jìn)行注射，獲得了較高的受精率和卵裂率。

本研究初步探討了封閉式薄片法在睪丸單精子冷凍中應(yīng)用的可行性。由于NOA患者精子獲取困難且非常珍貴，故本研究嘗試用OA患者睪丸精子作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，應(yīng)用封閉式薄片法玻璃化冷凍方式進(jìn)行冷凍，復(fù)蘇后獲得較高的精子回收率與存活率，并取得了與新鮮睪丸精子相似的受精率與卵裂率。雖然OA患者的精子質(zhì)量不能等同于NOA患者，但本研究結(jié)果為日后NOA患者單精子冷凍保存應(yīng)用于臨床奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Bunge RG，Sherman JK.Fertilizing capacity of frozen human spermatozoa[J]. Nature，1953，172（4382）：767-768.

[2]Schuster TG，Keller LM，Dunn RL，et al.Ultra-rapid freezing of very low numbers of sperm using cryoloops[J].Hum Reprod，2003，18（4）：788-795.

[3]馬超，胡明廣，王贊滔，等.封閉式薄片法對人類微量精子超快速玻璃化冷凍的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2015，24（10）：762-764.

[4]陳子江.人類生殖與輔助生殖[M].北京：科學(xué)出版社，2005：373-460.

[5]Abdel Raheem A，Rushwan N，Garaffa G，et al.Factors influencing intracytoplasmic sperm injection （ICSI） outcome in men with azoospermia[J].BJU Int，2013，112（2）：258-264.

[6]Isachenko V，Isachenko E，Petrunkina AM，et al.Human spermatozoa vitrified in the absence of permeable cryoprotectants：birth of two healthy babies[J].Reprod Fertil Dev，2012，24（2）：323-326.

[7]Endo Y，F(xiàn)ujii Y，Kurotsuchi S，et al.Successful delivery derived from vitrified-warmed spermatozoa from a patient with nonobstructive azoospermia[J].Fertil Steril，2012，98（6）：1423-1427.

[8]Nawroth F，Isachenko V，Dessole S，et al.Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants[J].Cryo Letters，2002， 23（2）：93-102.

[9]靳鐳，鄭家鳳，劉群，等.微滴無保護(hù)劑玻璃化法冷凍附睪微量精子的研究[J].中華男科學(xué)雜志，2010，16（12）：1089-1094.

[10]Walmsley R，Cohen J，F(xiàn)errara-Congedo T，et al.The first births and ongoing pregnancies associated with sperm cryopreservation within evacuated egg zonae[J].Hum Reprod，1998，13（Suppl 4）：61-70.

[11]Desai NN，Blackmon H，Goldfarb J.Single sperm cryopreservation on cryoloops： an alternative to hamster zona for freezing individual spermatozoa[J].Reprod Biomed Online，2004，9（1）：47-53.

[12]Isachenko V，Isachenko E，Montag M，et al.Clean technique for cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa[J].Reprod Biomed Online，2005，10（3）：350-354.

[13]Sohn JO，Jun SH，Park LS，et al.Comparison of recovery and viability of sperm in ICSI pipette after ultra rapid freezing or slow freezing[J].Fertil Steril，2003，80：128.

[14]Kuznyetsov V，Moskovtsev SI，Crowe M，et al.Vitrification of a small number of spermatozoa in normozoospermic and severely oligozoospermic samples[J].Syst Biol Reprod Med，2015，61（1）：13-17.

[15]鄶艷榮，賀占舉，蔡學(xué)泳，等.凍存睪丸精子用于男性生殖力儲備的探討[J].中華男科學(xué)雜志，2012，18（3）：231-234.

[16]Levron J，Madgar I，Shefi S，et al.IVF outcome with cryopreserved testicular sperm[J].Andrologia，2011，43（1）：48-51.

[17]張靜雯，伍捷陽，池霖生，等.睪丸不動精子行卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射的臨床效果分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，（7）：107-109.

[18]Ma S，Nigro MK，Rowe T，et al.Selection of viable sperm from frozen-thawed immotile spermatozoa based on the phenomenon of sperm tail curling in men who underwent testicular biopsy and epididymal sperm aspiration[J].Fertil Steril，2000，74（1）：172-173.

（收稿日期：2017-06-27 本文編輯：崔建中）endprint