汪霖

哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025

重組人促卵泡激素等電聚焦檢測(cè)方法研究

汪霖

哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025

人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone，h FSH)是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素[1]。在不孕不育的診斷和治療中，F(xiàn)SH 起著不可缺少的作用。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，成功生產(chǎn)出重組人促卵泡激素(rh FSH)。重組人促卵泡激素在臨床上使用的優(yōu)點(diǎn)是蛋白安全、穩(wěn)定、一致性高，避免了天然 FSH提取過程中出現(xiàn)的糖基化差異[2]。本文則應(yīng)用GE healthcare多功能水平電泳儀和Invitrogen垂直電泳儀對(duì)重組人促卵泡激素進(jìn)行等電聚焦項(xiàng)目的檢測(cè)，比較重組人促卵泡激素蛋白在水平與垂直電泳條件下的檢測(cè)差異，從而建立的一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離分析檢測(cè)方法。

重組人促卵泡激素；等電聚焦；比較

1.實(shí)驗(yàn)材料：

1.1 水平板等電聚焦實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 多功能水平電泳儀（GE healthcare，MultiphorⅡ）

1.1.2 等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品（GE healthcare，17-0456-01，等電點(diǎn)范圍：pI3 ～10）

1.1.3 兩性電解質(zhì)（GE healthcare，17-0456-01，等電點(diǎn)范圍：pI3 ～10）

1.1.4 兩性電極條（GE healthcare，18-1004-40）

1.1.5 灌膠支持膜（GE healthcare，80-1129-36）

1.1.6 上樣濾紙片（GE healthcare，80-1129-46）

1.1.7 丙烯酰胺(阿拉丁試劑有限公司)

1.1.8 N,N'-甲叉雙丙烯酰胺(南京化學(xué)試劑有限公司)

1.1.9 十二烷基磺酸鈉(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)

1.1.10 TEMED(Sigma)

1.1.11 甲醇（廣東科密歐化學(xué)試劑有限公司）

1.1.12 乙醇（廣東科密歐化學(xué)試劑有限公司）

1.1.13 考馬氏亮藍(lán)R-250（上海麥克林生化科技有限公司）

1.1.14 甘油（濟(jì)寧佰一化工有限公司）

1.1.15 磷酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）

1.1.16 氫氧化鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）

1.1.17 三氯乙酸（濟(jì)寧泰諾化工有限公司）

1.1.18 過硫酸銨（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）

1.2 水平板等電聚焦溶液配制

1.2.1.10%丙烯酰胺貯液：稱取丙烯酰胺10.0g，甲叉雙丙烯酰胺0.3g ，加水溶解，定溶至100ml，濾紙過濾備用。

1.2.2 電極液：

1mol/L磷酸溶液（陽(yáng)極液）：取6.4ml的濃磷酸，加水至100ml，備用

1mol/L氫氧化鈉溶液（陰極液）：取氫氧化鈉 4g，加水至100ml，備用

1.2.3 50%甘油：取甘油50g,加水混合均勻后定容至 100ml，備用。

1.2.4 固定液（10%TCA）：稱取三氯乙酸10g，加水溶解，用水定容至100ml，備用。

1.2.5 脫色液：量取甲醇50ml ，乙酸50ml，加水至500ml，備用。

1.2.6 染色液：稱取考馬氏亮藍(lán) R-250 0.1g，加入脫色液100ml，備用。

1.2.7 電泳膠的配制：將GelBondPAG膜親水面朝內(nèi)，兩側(cè)壓上玻璃板，四周用夾子夾住。量取10%丙烯酰胺貯液 2.5ml，兩性電解質(zhì) 0.35ml，50%甘油 0.5ml，水 1.25ml ，10%APS 25μl，TEMED 6μl，注入玻璃板夾層，待凝聚后上樣。

1.3 垂直板等電聚焦實(shí)驗(yàn)材料

1.3.1 預(yù)制膠pH3-7（Invitrogen EC6645Box）

1.3.2 2*樣品處理液pH3-7（Invitrogen LC5371）

1.3.3 50倍陽(yáng)極液（Invitrogen LC5300）

1.3.4 10倍陰極液（Invitrogen LC5370）

1.3.5 等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品（GE healthcare，17-0456-01，等電點(diǎn)范圍：pI3 ～10）

1.4 垂直板等電聚焦溶液配制

1.4.1 固定液：稱取三氯乙酸 10g，加水溶解，用水定容至100ml，備用。

1.4.2 脫色液：量取甲醇50ml ，乙酸50ml，加水至500ml，備用。

1.4.3 染色液：稱取考馬氏亮藍(lán) R-250 0.1g，加入脫色液100ml，備用。

2.操作步驟：

2.1 水平板等電聚焦實(shí)驗(yàn)條件：

打開多功能水平電泳儀，5℃條件下預(yù)冷，待水平電泳板達(dá)到5℃條件下，水平電泳板滴入礦物油，將電極條用配好的陽(yáng)極電極液及陰極電極液潤(rùn)濕，預(yù)電泳30分鐘。用純化水將供試品稀釋至蛋白濃度1mg/ml，放置上樣濾紙片，每孔上樣20μl。用純化水按100ul/瓶復(fù)溶等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，放置上樣濾紙片，每孔上樣20μl。5℃條件下，電泳200V，30分鐘。

2.2 垂直板等電聚焦實(shí)驗(yàn)條件：

首先將預(yù)制膠固定于電泳槽中，分別在電泳槽內(nèi)外加入1×陽(yáng)極液及1×陰極液。將供試品蛋白濃度濃縮至2mg/ml以上, 1:1的加入2×樣品處理液，每孔按照20μg蛋白含量進(jìn)行上樣。用純化水按100μl/瓶復(fù)溶等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，每孔上樣20μl，上樣。4℃條件下，電泳100v，1h，電泳時(shí)間2.5小時(shí)。

2.3 染色脫色：

電泳結(jié)束后，即將凝膠放入固定液中固定 30分鐘，取出放入平衡液 20分鐘，再放入染色液中染色過夜，然后用脫色液浸洗至背影無(wú)色，掃描。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

我們公司研制的重組人促卵泡激素是利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)的生物分泌性蛋白[3]。重組人促卵泡激素的目的蛋白直接分泌于培養(yǎng)基中，經(jīng)過一系列的純化工藝獲得的真核細(xì)胞表達(dá)蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異，當(dāng)重組人促卵泡激素的凈電荷為零時(shí)，此時(shí)的蛋白pH為其蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。由電泳對(duì)比圖所示，rh FSH 的等電點(diǎn)在 3.5～5.2 這一區(qū)間之間，與文獻(xiàn)報(bào)道的PI范圍4.0～5.2區(qū)間范圍基本一致。并且從圖中可以直接判斷出，垂直板等電聚焦的電泳圖，無(wú)論是在條帶的范圍，還是在清晰程度上都優(yōu)于水平板等電聚焦電泳圖的效果。因此，采用垂直板等電聚焦電泳做重組人促卵泡激素等電點(diǎn)效果更好。

[1]張瑞雄 黃雪珍 蔡錦梅;不孕不育癥患者血清AMH、LH、FSH、E2檢測(cè)結(jié)果分析[J],海南醫(yī)學(xué),2016,21.

[2]熊盛,王一飛,錢垂文,羅勇,陳文吟,饒桂榮,粟寬源,余宙耀;抗 HBsAg單鏈抗體的等電點(diǎn)測(cè)定和結(jié)構(gòu)模擬[J],華南理工大學(xué)學(xué)報(bào),2003,11.

[3]陳寧,重組人促卵泡激素的質(zhì)量研究[D],吉林大學(xué),2007:66-69.

R473.5

A

1672-5018（2017）05-011-01