厲金雷+蔡劍輝+任約翰+左志貴

[摘要] 目的 研究賴氨酰氧化酶（LOX）基因G473A多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的關系，為結(jié)直腸癌腫瘤的風險評估提供依據(jù)。 方法 隨機選擇2010年5月～2014年8月我院收治的200例結(jié)直腸癌患者作為研究對象，并隨機選擇同期200例體檢健康者作為對照組，分別抽取所有研究對象的肘靜脈血5 mL和抽取基因組后對LOX基因G473A位點測序，檢測各個體LOX基因G473A的基因型。然后采用Logistic回歸分析不同LOX基因G473A基因型與結(jié)直腸癌患病風險之間的相關性。 結(jié)果 （1）結(jié)腸癌組GG、GA、AA基因型患者分別占47.37%（45/95）、41.05%（39/95）、11.58%（11/95）。攜帶GG基因型個體患結(jié)腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.71，95%CI=1.01～2.65，P=0.03；OR=3.94，95%CI=1.43～8.96，P=0.00）。（2）直腸癌組GG、GA、AA基因型患者分別占51.43%（54/105）、37.4%（39/105）、11.43%（12/105）。攜帶GG基因型個體患直腸癌的風險明顯低于AA基因突變型個體（OR=3.45，95%CI=1.61～8.03，P=0.00）。（3）結(jié)直腸癌組GG、GA、AA基因型患者分別占49.50%（99/200）、39.00%（78/200）、11.50%（23/200）。攜帶GG基因型個體患結(jié)直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.67，95%CI=1.01～2.18，P=0.03；OR=3.68，95%CI=1.81～7.65，P=0.00）。 結(jié)論 LOX基因G473A多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)病風險有一定關系，行LOX基因G473A多態(tài)性檢測在結(jié)直腸癌風險評估中具有一定的應用價值。

[關鍵詞] 賴氨酰氧化酶；基因多態(tài)性；結(jié)直腸癌；腫瘤風險評估

[中圖分類號] R735.3+5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）22-0001-05

[Abstract] Objective To study the relationship between the G473A polymorphism of lysyl oxidase（LOX） gene and the susceptibility of colorectal cancer， and to provide the basis for the risk assessment of colorectal cancer. Methods A total of 200 patients with colorectal cancer were enrolled in our hospital from May 2010 to August 2014.A total of 200 cases of normal physical examination were recruited as control group. All the subjects were given 5 mL of elbow vein blood. Genomic DNA was extracted from peripheral blood and the G473A locus of LOX gene was sequenced and the genotype was detected. Logistic regression was used to analyze the correlation between the G473A genotype of LOX gene and the risk of colorectal cancer. Results（1）The proportion of GG， GA and AA genotype in colorectal cancer group were 47.37%（45/95）， 41.05%（39/95）and 11.58%（11/95） respectively. The risk of colorectal cancer with GG genotype was significantly lower than that of GA and AA mutant individuals（OR=1.71， 95%CI=1.01～2.65， P=0.03； OR=3.94， 95%CI=1.43～8.96， P=0.00）.（2）The genotype of GG， GA and AA in rectal cancer group was 51.43%（54/105）， 37.4%（39/105） and 11.43%（12/105） respectively. The risk of rectal cancer with GG genotype was significantly lower than in AA mutant individuals（OR=3.45， 95%CI=1.61～8.03， P=0.00）.（3）The proportion of GG， GA and AA genotype in colorectal cancer group was 49.50%（99/200）， 39.00%（78/200） and 11.50%（23/200） respectively. The risk of colorectal cancer with GG genotype was significantly lower than that of GA and AA mutant individuals（OR=1.67， 95%CI=1.01～2.18， P=0.03； OR=3.68， 95%CI=1.81～7.65， P=0.00）. Conclusion The G473A polymorphism of LOX gene is associated with the risk of colorectal cancer. The detection of LOX gene G473A polymorphism has a certain value in the risk assessment of colorectal cancer.endprint

[Key words] LOX； Gene polymorphism； Colorectal cancer； Tumor risk assessment

結(jié)直腸癌是我國一種高發(fā)型腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。結(jié)直腸癌的早期癥狀并不明顯，早期的結(jié)直腸癌患者很容易被誤診為腸道功能障礙，往往確診時已經(jīng)處于晚期階段，且多發(fā)生血管和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2，3]。因此，早期診斷和檢測對于患者的治療具有非常重要的意義。大量研究表明在結(jié)直腸癌的發(fā)病過程中遺傳因素非常關鍵，然而結(jié)直腸癌的發(fā)病機制目前并沒有完全明確[4，5]。賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）是在細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中催化彈性蛋白和膠原聚合發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)的一種酶，增強ECM的穩(wěn)定性[6]。臨床研究顯示，LOX與腫瘤的關系密切，LOX基因表達的RNA和蛋白在眾多腫瘤中均有所下調(diào)，而在其他一些惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌等腫瘤的特殊發(fā)展時期的表達量顯著升高，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7，8]。據(jù)研究顯示LOX基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生具有一定的聯(lián)系[9]，本研究以我院收治的200例結(jié)直腸癌患者作為研究對象，分析LOX基因G473A多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇2010年5月～2014年8月我院收治的200例結(jié)直腸癌患者作為研究對象設為結(jié)直腸癌組，所有結(jié)直腸癌患者均經(jīng)過病理學確診，患者的年齡、性別、病例分期均不限，所有患者的臨床資料均完整，抽取每位患者的空腹靜脈血5 mL，抽血前確認患者沒有接受過放化療治療。根據(jù)所選擇的結(jié)直腸癌患者的年齡、性別等一般資料匹配選擇200例在我院體檢的健康者作為對照組。200例結(jié)直腸癌患者中結(jié)腸癌組95例，根據(jù)該患者的年齡、性別等一般資料從對照組中匹配選擇95例作為對照組1；直腸癌組患者105例，根據(jù)該患者的年齡、性別等一般資料從對照組中匹配選擇105例作為對照組2。所有研究對象均不存在家族腫瘤史。本研究獲得了我院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有參與本研究的對象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

（1）所有研究對象均抽取肘靜脈血5 mL左右，采用Qiagen血液DNA提取試劑盒（Qiagen 51104）抽提血液中DNA，80 μL洗脫后-80℃保存。（2）設計LOX的G473A多態(tài)性檢測的PCR擴增引物。上游引物為5-TTCCAAGCTGGCTACTCGAC-3；下游引物為5-CAGGTCTGGGCCTT-TCATAA-3[10]。（3）PCR擴增。反應體系為25 μL，其中5 μM的上下游引物各1 μL，2.5 μL的10×PCR buffer，0.8 μL MgCl2（50 mM），0.5 μL dNTP（10 mM），上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL（PCR反應試劑購于金斯瑞生物科技，產(chǎn)品編號E00007-1000）。PCR反應條件為94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火57℃，40 s；延伸72℃，30 s；35個循環(huán)，72℃，5 min，4℃保存。PCR擴增后送杭州九洋生物科技有限公司測序。測序完成后采用Chromas軟件分析。

1.3 研究方案

結(jié)腸癌組的年齡界限為61歲，直腸癌組和結(jié)直腸癌組的年齡界限為59歲。分別統(tǒng)計結(jié)腸癌組和對照組1年齡<61歲、≥61歲、男性、女性、吸煙與不吸煙例數(shù)；直腸癌組和對照組2年齡<59歲、≥59歲、男性、女性、吸煙與不吸煙例數(shù)。根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計分析各組GG型、GA型、AA型基因人數(shù)，分析各基因型與結(jié)直腸癌患者年齡、性別和吸煙狀態(tài)的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學分析軟件，結(jié)腸癌組與對照組1、直腸癌組與對照組2、結(jié)直腸癌組與對照組的基因型頻數(shù)分別進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，P>0.05表示所選樣本人群的基因頻率符合遺產(chǎn)平衡法則，具有代表性。計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。采用多變量Logistic回歸分析計算OR值和95%CI，分析結(jié)直腸癌的發(fā)病風險，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

結(jié)腸癌組、直腸癌組及結(jié)直腸癌組患者與各自對照組之間的年齡組成、性別比例和吸煙狀態(tài)之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1～3。

2.2 結(jié)直腸癌患者與對照組之間LOX的G473A基因多態(tài)性分布

結(jié)直腸癌組患者與各自對照組的LOX G473A基因多態(tài)性分布情況見表4，各基因型測序結(jié)果見封三圖1。分別對結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌患者與各對照組進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，P>0.05說明所選樣本人群的基因頻率符合遺產(chǎn)平衡法則，具有代表性。結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌患者與各對照組之間不同G473A基因型之間的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。采用多變量Logistic回歸分析結(jié)果顯示，攜帶GG基因型個體患結(jié)腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.71，95%CI=1.01～2.65，P=0.03；OR=3.94，95%CI=1.43～8.96，P=0.00）。攜帶GG基因型個體患直腸癌的風險明顯低于AA基因突變型個體（OR=3.45，95%CI=1.61～8.03，P=0.00）。攜帶GG基因型個體患結(jié)直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.67，95%CI=1.01～2.18，P=0.03；OR=3.68， 95%CI=1.81～7.65，P=0.00）。

2.3 LOX基因G473A等位基因的多態(tài)性與結(jié)直腸癌患者年齡、性別和吸煙狀態(tài)的相關性

結(jié)腸癌組患者中年齡<61歲患者、女性患者和吸煙的患者攜帶GG基因型個體患結(jié)腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=3.01，95%CI= 1.19～9.21，P=0.01；OR=2.35，95%CI=1.04～4.32，P=0.02；OR=3.55，95%CI=1.22～9.32，P=0.02）。直腸癌組患者中女性患者和不吸煙的患者攜帶GG基因型個體患直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=2.04，95%CI=1.21～3.92，P=0.01；OR=1.71，95%CI=1.11～2.53，P=0.02）；結(jié)直腸癌組患者中年齡<59歲患者、≥59歲、女性患者和不吸煙的患者攜帶GG基因型個體患結(jié)直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.73，95%CI=0.98～2.47，P=0.04；OR=1.72， 95%CI=1.01～2.62，P=0.02；OR=2.22，95%CI=1.27～3.83，P=0.00；OR=1.78，95%CI=1.19～2.53，P=0.00）。見表5。endprint

3 討論

結(jié)直腸癌（colorectal，CRC）是一種常見的惡性腫瘤，近年來隨著我國居民生活水平的上升以及飲食習慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸上升。結(jié)直腸癌的預后與早期診斷密切相關，早期結(jié)直腸癌的5年生存率高達90%，而晚期結(jié)直腸癌的生存率不到10%[11]。結(jié)直腸癌的早期診斷的主要方法是內(nèi)鏡[12]，目前我國結(jié)直腸癌的早期診斷率明顯低于歐美發(fā)達國家[13]。因此，提高我國結(jié)直腸癌的早期診斷率，降低結(jié)直腸癌的死亡率對于提高我國居民健康水平具有重要的意義。

賴氨酰氧化酶（LOX）是由纖維細胞分泌的銅依賴性酶，引發(fā)膠原和彈性蛋白的交聯(lián)，穩(wěn)定細胞外基質(zhì)（ECM），增加的LOX活性與纖維化疾病如肺和肝纖維化和動脈粥樣硬化有關[14]，而LOX活性降低與動物模型中的硫酸鹽誘導性肺氣腫和銅代謝障礙（如Menkes綜合征）有關，因此，LOX在器官形態(tài)發(fā)生和組織修復中起著重要作用[15]。最近，LOX已經(jīng)顯示出在癌發(fā)生中具有雙重功能。作為腫瘤抑制因子，其抑制H-ras誘導的腫瘤發(fā)生[16]，而作為腫瘤增強劑，其在缺氧條件下促進腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。LOX可以氧化除膠原蛋白和彈性蛋白以外的各種球狀蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基[14]。通過LOX氧化堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）阻斷bFGF刺激的細胞和具有高致瘤潛力的bFGF-自分泌轉(zhuǎn)化細胞的增殖[18]。純化的成熟牛LOX顯示單核細胞和血管平滑肌細胞的趨化活性[19]。因此，LOX是一種執(zhí)行多重生物功能的關鍵細胞內(nèi)和細胞外效應物。據(jù)研究顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病風險與其遺傳因素具有一定的相關性，其中LOX基因的G473A位點的多態(tài)性是相關腫瘤的高風險因素[20]。LOX基因位于人類第5號染色體上，LOX基因家族共有5個成員，分別為LOX、LOXL、LOXL2、LOXL3和LOXL4，各家族的不同在于其N末端的差異導致其在發(fā)育、衰老以及調(diào)控腫瘤的生長發(fā)育方面發(fā)揮的作用具各不相同[21]。有研究顯示LOX基因的多態(tài)性位點眾多，分別分布于非編碼區(qū)、編碼區(qū)以及基因間區(qū)，非編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）主要影響基因片段與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等，編碼區(qū)的SNP主要是改變氨基酸的序列[22]，研究顯示這些SNP能夠提高機體對藥物、環(huán)境以及相關致病因子的敏感性，從而增加患癌的風險[23]。LOX基因SNP中，G473A是一個非常重要且頻發(fā)的SNP，473位點處的G突變?yōu)锳，導致多肽的精氨酸158突變?yōu)楣劝滨０罚瑢е孪嚓P腫瘤的發(fā)生[23]。本研究結(jié)果顯示，攜帶GG基因型個體患結(jié)腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.71，95%CI=1.01～2.65，P=0.03；OR=3.94，95%CI=1.43～8.96，P=0.00）。攜帶GG基因型個體患直腸癌的風險明顯低于AA基因突變型個體（OR=3.45，95%CI=1.61～8.03，P=0.00）。攜帶GG基因型個體患結(jié)直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.67，95%CI=1.01～2.18，P=0.03；OR=3.68， 95%CI=1.81～7.65，P=0.00）。LOX基因的G473A位點多態(tài)性在我國人群中比較常見，本研究結(jié)果顯示，200例體檢正常人中GG型占61.50%，GA型占34.50%，AA型占4.00%。結(jié)腸癌患者中GG型占47.37%，GA型占41.05%，AA型占11.58%。直腸癌患者中GG型占51.43%，GA型占34.29%，AA型占3.81%。可以明顯看出結(jié)腸癌患者的G473A位點突變率較高，與相關研究結(jié)果一致[24]。另外，本研究分別調(diào)查了不同年齡階段、不同性別以及是否吸煙等人群結(jié)直腸癌的發(fā)生風險，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組患者中年齡<61歲患者、女性患者和吸煙的患者攜帶GG基因型個體患結(jié)腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=3.01，95%CI=1.19～9.21，P=0.01；OR=2.35，95%CI=1.04～4.32，P=0.02；OR=3.55，95%CI=1.22～9.32，P=0.02）。直腸癌組患者中女性患者和不吸煙的患者攜帶GG基因型個體患直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=2.04，95%CI=1.21～3.92，P=0.01；OR=1.71，95%CI=1.11～2.53，P=0.02）；結(jié)直腸癌組患者中年齡<59歲患者、≥59歲、女性患者和不吸煙的患者攜帶GG基因型個體患結(jié)直腸癌的風險明顯低于GA和AA基因突變型個體（OR=1.73，95%CI=0.98～2.47，P=0.04；OR=1.72，95%CI=1.01～2.62，P=0.02；OR=2.22，95%CI=1.27～3.83，P=0.00；OR=1.78，95%CI=1.19～2.53，P=0.00）。通過這些結(jié)果可以為臨床結(jié)直腸癌的防治和風險評估提供依據(jù)，同時也可以為結(jié)直腸癌的早期診斷和預防提高參考。

綜上所述，LOX基因G473A多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)病風險有一定關系，對LOX基因G473A多態(tài)性進行檢測能為結(jié)直腸癌風險評估提供理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 李道娟，李倩，賀宇彤. 結(jié)直腸癌流行病學趨勢[J]. 腫瘤防治研究，2015，42（3）：305-310.

[2] 柏愚，楊帆，馬丹，等. 中國早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南（2014年，北京）[J]. 胃腸病學，2015，32（6）：345-365.

[3] 張彥斌，劉月，葉穎江，等. 結(jié)直腸癌相關腫瘤標志物的定量蛋白質(zhì)組學研究[J]. 中華普通外科雜志，2016， 31（10）：839-842.

[4] 郜文秀，古小玲，駱菊英，等. NAT2基因多態(tài)性與大腸癌遺傳易感性關系[J]. 中國公共衛(wèi)生，2015，31（5）：645-647.endprint

[5] 李嬌元， 常江， 朱穎，等. 基于常見遺傳變異和傳統(tǒng)風險因素的中國南方漢族人群結(jié)直腸癌風險預測模型研究[J]. 中華流行病學雜志，2015，36（10）：1053-1057.

[6] Matsuura S，Mi R，Koupenova M，et al. Lysyl oxidase is associated with increased thrombosis and platelet reactivity[J]. Blood，2016，127（11）：1493.

[7] 高國政. LOX在腫瘤中的研究進展[J]. 實用檢驗醫(yī)師雜志，2011，3（3）：181-183.

[8] 吳穎，楊繼鑫，李南林，等. LOX家族與乳腺癌相關性研究進展[J]. 中華腫瘤防治雜志，2015，22（17）：1412-1416.

[9] 石曉明，吳勝春，楊永賓，等. 結(jié)直腸癌患者外周血賴氨酰氧化酶基因多態(tài)性及其臨床意義[J]. 上海醫(yī)學，2016，39（3）：160-163.

[10] Yoon JH，Park JK，Kang YH，et al. Lysyl oxidase G473A polymorphism is closely associated with susceptibility to gastric cancer in a South Korean population[J]. Apmis，2011，119（11）：762.

[11] Courtney RJ，Paul CL，Carey ML，et al. A population-based cross-sectional study of colorectal cancer screening practices of first-degree relatives of colorectal cancer patients[J]. BMC Cancer，2013，13（1）：1-11.

[12] 潘駿，柏愚，李兆申. 結(jié)直腸癌內(nèi)鏡篩查研究進展[J]. 中華消化內(nèi)鏡雜志，2015，32（10）：707-710.

[13] Carter JV，Galbraith NJ，Yang D，et al. Blood-based microRNAs as biomarkers for the diagnosis of colorectal cancer：A systematic review and meta-analysis[J]. British Journal of Cancer，2017，116（6）：762-774.

[14] Kagan HM，Li W. Lysyl oxidase：Properties，specificity，and biological roles inside and outside of the cell.[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2003，88（4）：660.

[15] Kim Y，Peyrol S，So CK，et al. Coexpression of the lysyl oxidase-like gene（LOXL）and the gene encoding type Ⅲ procollagen in induced liver fibrosis[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2015，72（2）：181-188.

[16] Kenyon K，Contente S，Trackman PC，et al. Lysyl oxidase and rrg messenger RNA[J]. Science，1991，253（5021）：802.

[17] Erler JT，Bennewith KL，Nicolau M，et al. Lysyl oxidase is essential for hypoxia-induced metastasis[J]. Nature，2006，440（7088）：1222-1226.

[18] Li W，Nugent MA，Zhao Y，et al. Lysyl oxidase oxidizes basic fibroblast growth factor and inactivates its mitogenic potential[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2003，88（1）：152.

[19] Li W，Zhou J，Chen L，et al. Lysyl oxidase，a critical intra-and extra-cellular target in the lung for cigarette smoke pathogenesis[J]. International Journal of Environmental Research &Public Health，2011，8（1）：161-84.

[20] Wang G，Shen Y，Cheng G，et al. Lysyl oxidase Gene G473a polymorphism and cigarette smoking in association with a high risk of lung and colorectal cancers in a north Chinese population[J]. International Journal of Environmental Research & Public Health，2016，13（7）：635.

[21] Baker AM，Bird D，Welti JC，et al. Lysyl oxidase plays a critical role in endothelial cell stimulation to drive tumor angiogenesis[J]. Cancer Research，2013，73（2）：583.

[22] 王健. Survivin基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的相關性分析[J]. 中國醫(yī)學創(chuàng)新，2016，13（14）：7-10.

[23] Pichu S，Sathiyamoorthy J，Vimalraj S，et al. Impact of lysyl oxidase（G473A） polymorphism on diabetic foot ulcers[J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，25（103）：242.

[24] 沈艷青，林佳，程光，等. 賴氨酰氧化酶基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的相關性[J]. 中華消化雜志，2016， 36（1）：35-40.

（收稿日期：2017-05-11）endprint