王禮寧，馬勇，鄭蘇陽，郭楊，袁翰，孫杰

[1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 骨傷研究所（骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室），江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨傷科，江蘇 南京 210029]

基礎(chǔ)研究·論著

大鼠骨髓單核細(xì)胞的快速分離方法及向破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化*

王禮寧1，馬勇2，鄭蘇陽1，郭楊1，袁翰1，孫杰1

[1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 骨傷研究所（骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室），江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨傷科，江蘇 南京 210029]

目的建立一種簡便高效的體外分離大鼠骨髓單核細(xì)胞的方法，觀察其體外生長特性，并誘導(dǎo)其分化為破骨細(xì)胞。方法無菌條件下分離出SD大鼠的脛骨和股骨，使用環(huán)氧樹脂管（EP管）和移液槍頭快速分離骨髓組織，再用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后收集懸浮細(xì)胞，加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增后得到貼壁的骨髓單核細(xì)胞。觀察骨髓單核細(xì)胞生長過程中的形態(tài)學(xué)特征；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法（CCK-8）測繪細(xì)胞的生長曲線；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)；在加入M-CSF和核因子κB受體活化因子配基（RANKL）誘導(dǎo)分化后，用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和降鈣素受體（CTR）免疫熒光染色鑒定其是否能分化為成熟破骨細(xì)胞。結(jié)果通過該方法獲得的大鼠骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)1d后基本呈小圓形，雜細(xì)胞較少。3d后細(xì)胞數(shù)目稍多，兩端開始出現(xiàn)觸角，5d后數(shù)目增多，細(xì)胞呈橢圓形，兩端觸角明顯；細(xì)胞的增殖依賴于M-CSF；流式結(jié)果顯示，通過此方法獲得的單核細(xì)胞純度較高；TRAP染色和CTR免疫熒光染色結(jié)果提示，通過該方法獲得的單核細(xì)胞可以誘導(dǎo)為成熟破骨細(xì)胞。結(jié)論通過EP管和移液槍頭裝置可快速分離獲取單核細(xì)胞，獲得的細(xì)胞表型穩(wěn)定，適合用于骨代謝疾病的進(jìn)一步研究。

分離培養(yǎng)方法；破骨細(xì)胞；骨髓單核細(xì)胞；分化；骨代謝疾病

破骨細(xì)胞是生理狀態(tài)下唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞[1]。骨吸收作為骨重建過程的重要環(huán)節(jié)，與骨形成具有相同重要的地位[2]。病理狀態(tài)下破骨細(xì)胞所引起的過度骨吸收是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝疾病的重要病理過程[3]。因此，如何獲得破骨細(xì)胞是進(jìn)一步研究骨代謝疾病的關(guān)鍵。然而，破骨細(xì)胞作為一種高代謝終末分化細(xì)胞，具有無法傳代、存活時(shí)間短等特點(diǎn)，且破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量極少，機(jī)械分離獲取困難[4]。所以目前獲取破骨細(xì)胞的常規(guī)方法多是通過骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)。通過該方法獲得的破骨細(xì)胞在數(shù)量、純度及成熟度等方面均優(yōu)于脾細(xì)胞誘導(dǎo)法和外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)法[5-6]。但是作者在使用傳統(tǒng)的注射器沖洗骨髓腔分離骨髓細(xì)胞的方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)該方法的一些局限性。如：①分離新生動(dòng)物的長骨時(shí)需要盡量將周圍軟組織去除，這樣需要較高的外科技術(shù)和較多的時(shí)間；②新生乳鼠的長骨極小且脆，在分離的過程中易折斷導(dǎo)致骨髓流出；③新生乳鼠的骨髓腔極細(xì)，通常只有針眼大小，使用注射器沖洗時(shí)十分困難，無法將骨髓完全沖出。因此，本文探討建立一種簡便高效的體外分離、擴(kuò)增骨髓單核細(xì)胞的方法，為進(jìn)一步探索骨代謝疾病提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

出生24h內(nèi)的SD大鼠雌雄各2只[來源于南京青龍山動(dòng)物繁殖場，合格證書：SCXK（蘇）2012-0008]。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合 2009年《Ethical issues in animal experimentation》相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。

1.2 試劑與儀器

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和核因子κB受體活化因子配基（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）（購自美國Peprotech公司），藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）熒光標(biāo)記的CD11b抗體及其同型對照抗體（購自美國BD公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒、赫斯特（Hochest33342）熒光染液（購自美國SIGMA公司），兔抗大鼠降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）抗體（購自北京博奧森公司），Alexa-488標(biāo)記的山羊抗兔（購自英國Abcam公司）二抗，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、基本培養(yǎng)基（alpha minimum essential medium，α-MEM）（購自美國GIBCO公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8）（購自日本同仁化學(xué)研究所），倒置相差顯微鏡CKX31型（日本Olympus光學(xué)儀器株式會(huì)社），徠卡倒置熒光顯微鏡DMI-3000型（德國徠卡公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱BB16/BB5060型（德國Heraus公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司），多功能酶標(biāo)儀（美國PE公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠骨髓單核細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)[7]無菌條件下分離出新生大鼠的脛骨和股骨，并放入無血清α-MEM中備用；將1ml移液槍頭下端1cm剪下，使用鑷子將吸液口擴(kuò)大，將大鼠長骨從中間剪斷，斷面朝下，各放入1個(gè)移液槍頭中，再將槍頭轉(zhuǎn)移至1.5ml環(huán)氧樹脂（epoxy epoxide，EP）管中，形成一個(gè)特殊的骨髓分離裝置（見圖1）；將EP管6 000r/min離心30 s。然后將EP管中的槍頭移除，每管用含1%青鏈雙抗（penicillin-streptomycin，PS）、5%胎牛血清FBS的α-MEM培養(yǎng)基200μl吹打重懸，將細(xì)胞懸液從200目篩網(wǎng)中濾過后，1 500r/min離心5min，棄上清液；加入10倍于細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，冰上裂解8min，1 500r/min離心5min，棄紅色上清液；用含25ng/ml的M-CSF、1%PS、5% FBS的α-MEM培養(yǎng)基重懸，并按照4×105個(gè)/cm2的密度接種，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培育箱靜置培養(yǎng)過夜；收集上清液1 200r/min離心5min，用 含 25ng/ml的 M-CSF、1%PS、5%FBS的α-MEM重懸，直至細(xì)胞增殖的合適密度后，用含25ng/ml的M-CSF、100ng/ml的RANKL、1%PS、5% FBS的α-MEM進(jìn)行誘導(dǎo)。

圖1 骨髓分離提取裝置簡單示意圖

1.3.2 大鼠骨髓單核細(xì)胞生長曲線的繪制[8]取對數(shù)生長期的原代大鼠單核細(xì)胞數(shù)量按照104/孔，分為兩組，每組8孔，一組加入含100ng/ml的M-CSF的含血清培養(yǎng)基，另外一組只加完全培養(yǎng)基，各100μl。分別在接種后的第1、3、5、7和9天，以CCK-8法檢測其細(xì)胞活力。每次檢測時(shí)均加入10μl的CCK-8檢測液，放入培養(yǎng)箱中孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm處的吸光度，每組取8孔測定值做統(tǒng)計(jì)分析后，繪制生長曲線。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠骨髓單核細(xì)胞CD11b的表達(dá) 將生長狀態(tài)良好的原代大鼠單核細(xì)胞輕輕吹下，調(diào)整密度至106/ml，收集于2個(gè)EP管中各400μl，各加入含1%FBS[用1%疊氮鈉（NAN3）溶解]200μl冰上封閉30min，并標(biāo)記A、B。A管加入0.5μl同型對照抗體，B管加入0.5μl CD11b熒光抗體，冰上靜置30min。離心后用PBS清洗2次，轉(zhuǎn)移到流式管中上機(jī)檢測。

1.3.4 大鼠骨髓單核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化以及TRAP染色 將純化增殖后原代大鼠骨髓單核細(xì)胞輕輕吹下，離心重懸后按照1.5×105/cm2的密度接種，并在培養(yǎng)基中加入 25ng/ml的 M-CSF、100ng/ml的RANKL，每2天半量換液[9]。直至6d后可在鏡下發(fā)現(xiàn)大量融合的多核細(xì)胞，即可行抗酒石酸酸性磷酸酶（TARP）染色，細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定10min后，按照Sigma試劑盒說明書進(jìn)行染色，染色后盡快在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 免疫熒光檢測誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞中CTR的表達(dá) 同樣將純化增殖后原代大鼠骨髓單核細(xì)胞按照1.5×105/cm2的密度接種，誘導(dǎo)方法同前。培養(yǎng)6d后將細(xì)胞用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10min，加入含0.3%Triton-X100的PBS冰上放置30min，再加入含5%FBS的PBS冰上封閉30min，加入兔抗大鼠CTR抗體（1∶100稀釋）后4℃過夜。次日PBS洗3次后，加入Alexa-488標(biāo)記的山養(yǎng)抗兔二抗37℃孵育1h后，PBS洗3次。再用Hochest33342染液復(fù)染細(xì)胞核10min，PBS洗3次后。熒光顯微鏡下觀察熒光分布范圍及強(qiáng)度。

1.3.6 主要觀察指標(biāo) ①大鼠骨髓單核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。②大鼠骨髓單核細(xì)胞生長曲線的測繪結(jié)果。③大鼠骨髓單核細(xì)胞表面抗原CD11b的表達(dá)。④大鼠骨髓單核細(xì)胞分化后TARP染色結(jié)果。⑤大鼠骨髓單核細(xì)胞分化后降鈣素受體免疫熒光染色結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓單核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

分離培養(yǎng)過夜后收集的原代大鼠骨髓單核細(xì)胞在含25ng/ml的M-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1d后基本呈小圓形，雜細(xì)胞較少。3d細(xì)胞數(shù)目增多，體積稍大，大多呈橢圓形，部分細(xì)胞兩端長出觸角。5d后細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞觸角更加明顯，形態(tài)均一，大小一致，細(xì)胞密度可達(dá)90%以上。見圖2。

在信息化時(shí)代，企業(yè)要與時(shí)俱進(jìn)，根據(jù)市場需求和企業(yè)實(shí)際需求，利用信息化技術(shù)建立企業(yè)內(nèi)部資源共享平臺。同時(shí)利用企業(yè)員工學(xué)術(shù)交流、技術(shù)交流、深造等方式，整合國內(nèi)外先進(jìn)的經(jīng)驗(yàn)技術(shù)，研發(fā)一套符合自身企業(yè)發(fā)展的新思路和新技術(shù)，并且運(yùn)用到實(shí)際工作中。

2.2 大鼠骨髓單核細(xì)胞的生長曲線

通過CCK-8法測定大鼠骨髓單核細(xì)胞在有無M-CSF存在時(shí)生長增殖活性之間的差異。將各時(shí)間測得的光密度值（optical density，OD）繪制成生長曲線后，發(fā)現(xiàn)3d后各時(shí)間誘導(dǎo)組的細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。M-CSF可促進(jìn)大鼠骨髓單核細(xì)胞的增殖（見圖3），在接種前3d細(xì)胞的生長相對較緩，應(yīng)屬于平臺期。3d后細(xì)胞快速生長，進(jìn)入對數(shù)生長期。5d后細(xì)胞增速逐漸放緩，進(jìn)入平臺期。而未加入M-CSF的對照組生長基本停滯。提示M-CSF是大鼠骨髓單核細(xì)胞增殖過程中的必要生長因子。

2.3 大鼠骨髓單核細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)

圖2 原代大鼠骨髓單核細(xì)胞第1、3及5天的形態(tài) （倒置顯微鏡，標(biāo)尺=50μm）

圖3 原代大鼠骨髓單核細(xì)胞的生長曲線

流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，原代單核細(xì)胞表面CD11b表達(dá)率可達(dá)99.3%。見圖4。

2.4 大鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化后TRAP染色結(jié)果

誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后的大鼠骨髓單核細(xì)胞中出現(xiàn)大量體積較大（30～150μm）的細(xì)胞，細(xì)胞多呈橢圓形或不規(guī)則形，TRAP染色后可見胞漿中有紫紅色顆粒，分布均勻，偽足和褶皺清晰可見，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，每個(gè)細(xì)胞中可見大量細(xì)胞核，大部分細(xì)胞呈TRAP陽性。而未誘導(dǎo)的大鼠骨髓單核細(xì)胞TRAP染色呈陰性。見圖5。

2.5 大鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化后CTR的熒光表達(dá)

誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后的大鼠骨髓單核細(xì)胞免疫熒光染色后細(xì)胞膜和核周細(xì)胞質(zhì)中均呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，Hochest33342染色可見誘導(dǎo)后的細(xì)胞的核中呈藍(lán)色熒光，每個(gè)細(xì)胞中基本含有≥3個(gè)的細(xì)胞核。而未誘導(dǎo)的大鼠骨髓單核細(xì)胞中則不存在CTR的表達(dá)。見圖6。

圖4 原代大鼠骨髓單核細(xì)胞表面CD11b表達(dá)

圖5 M-CSF和RANKL誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化后的TRAP染色 （倒置顯微鏡，標(biāo)尺=50μm）

圖6 免疫熒光染色觀察誘導(dǎo)組中CTR的表達(dá) （熒光顯微鏡，標(biāo)尺=20μm）

3 討論

目前，除了使用骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞外，使用小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系（RAW264.7細(xì)胞系）細(xì)胞系誘導(dǎo)也是一種常用的方法。小鼠RAW264.7是Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/C小鼠腫瘤生成后，收集小鼠腹水中單核樣巨噬細(xì)胞從而得到的細(xì)胞株[10]。其突破破骨前體細(xì)胞存活時(shí)間短的限制，使得人們能從中穩(wěn)定獲取破骨樣細(xì)胞，從而受到一部分研究者的青睞。然而，由于RAW264.7是細(xì)胞系，與原代細(xì)胞基因系是否存在差異仍然不得而知[11]。而骨髓單核細(xì)胞作為一種較其更為前體的破骨前體細(xì)胞，采用其作為研究對象則更有說服力[12]。多項(xiàng)研究也已證實(shí)[13-14]，通過骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)而來的破骨細(xì)胞較通過RAW264.7誘導(dǎo)而來的細(xì)胞數(shù)量更多、骨吸收功能更活躍。但是傳統(tǒng)的原代細(xì)胞特別是骨髓細(xì)胞的分離提取過程較為復(fù)雜，需要消耗研究者大量的時(shí)間和精力。因此，筆者希望能夠建立一套更為簡易、行之有效的體外分離、純化和大量擴(kuò)增骨髓單核細(xì)胞的方法。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室中常見的EP管和移液槍頭作為工具，使其在只需要粗略分離骨骼周圍軟組織的情況下，就能夠獲取大量較純的骨髓組織，同時(shí)也避免精細(xì)分離過程中骨干斷裂、骨髓沖洗不徹底的情況，大大降低原代分離的工作量。然后用紅細(xì)胞裂解液去除骨髓中的紅細(xì)胞，并使用經(jīng)典的藥物貼壁篩選法進(jìn)一步純化骨髓細(xì)胞[8]。由于骨髓間充質(zhì)細(xì)胞更容易貼壁的特性，將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，收集懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子。在生長因子的刺激下，其中的單核細(xì)胞大量增殖貼壁。隔天半量換液，去除懸浮細(xì)胞剩余的淋巴細(xì)胞等雜細(xì)胞。5d后可見培養(yǎng)皿中存在大量的骨髓單核細(xì)胞，純度可達(dá)85%～90%。

通過CCK-8法測繪的大鼠骨髓單核細(xì)胞的生長曲線觀察該細(xì)胞的生長特性，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞只有在巨噬細(xì)胞集落刺激因子存在的情況下才具有增殖的能力。整個(gè)生長周期可分為潛伏期（1～2d）、對數(shù)生長期（3～7d）、平臺期（7d后）。說明大鼠骨髓單核細(xì)胞可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增1周時(shí)間。CD11b作為單核細(xì)胞表面的重要抗原之一[15-16]，在原代大鼠骨髓單核細(xì)胞中的表達(dá)率高達(dá)99.3%，提示通過該方法獲得的單核細(xì)胞具有較高的純度。TRAP是破骨細(xì)胞的特征性酶，是破骨細(xì)胞重要的酶組化識別標(biāo)志之一[17]。CTR只在定向破骨細(xì)胞前體和成熟破骨細(xì)胞中表達(dá)，是破骨細(xì)胞特異性鑒別指標(biāo)之一[18]。通過本方法獲取的細(xì)胞在相關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化5d后，可成功的通過TRAP染色和CTR免疫熒光染色鑒定為成熟的破骨細(xì)胞，進(jìn)一步證明通過該方法獲取的骨髓單核細(xì)胞可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性地采用由實(shí)驗(yàn)室中普通的耗材合成的簡易骨髓提取裝置，成功地縮短整個(gè)原代提取過程從需要的時(shí)間和工作量，提高原代提取方法的效率。通過該方法得到大鼠骨髓單核細(xì)胞具有單核細(xì)胞的一般生物學(xué)特征，經(jīng)過鑒定能夠成功誘導(dǎo)為成熟破骨細(xì)胞。該方法具有簡便可行的優(yōu)點(diǎn)，能夠在短時(shí)間、低成本的條件下獲取一批數(shù)量可觀、性狀穩(wěn)定、活性較高的骨髓單核細(xì)胞，為后續(xù)的骨代謝疾病的基礎(chǔ)研究提供可靠穩(wěn)定的細(xì)胞來源。

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A method about isolation and cultivation of rat bone marrow monocytes and differentiation into osteoclasts*

Li-ning Wang1,Yong Ma2,Su-yang Zheng1,Yang Guo1,Han Yuan1,Jie Sun1
[1.Institute of Traumatology(Laboratory of New Technology on Bone Trauma Repairment and Reconstruction),Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China; 2.Department of Orthopedics,Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210029,China)

ObjectiveTo establish a simple and efficient method to isolate the rat bone marrow monocytes in vitro,observe the characteristics of growth and induce the differentiation of osteoclasts.MethodsThe tibia and femur of SD rats were isolated under aseptic condition.The bone marrow tissues were separated by EP tube and the transfer gun head.Red blood cell lysate was used to remove the red blood cells.The suspended cells were collected after cell culture overnight.Then M-CSF was added to culture the cells and adherent bone marrow monocytes were obtained.The growth process of bone marrow monocytes was morphologically observed.The cell growth curve was measured by CCK-8.Flow cytometry was used to detect CD11b expression on cell surface.After differentiation of the monocytes by adding M-CSF and RANKL,TRAP staining and CTR immunofluorescence staining were used to identify whether they can differentiate to matureosteoclasts.ResultsThe rat bone marrow monocytes obtained after culturing for 1 day by these methods showed small circular shape with few mixed cells.After 3 days,the number of the cells increased slightly and the antennae began to appear at both sides.After 5 days,the cells increased significantly and were in oval shape,the antennae at both sides were obvious.The cell proliferation depended on M-CSF.Flow cytometryshowed thatmonocytesobtained had high purity by thismethod.TRAP staining and CTR immunofluorescence staining results showed that monocytes obtained by this method could be successfully induced to mature osteoclasts.ConclusionsMonocytes can be isolated and obtained rapidly by this method. The phenotype of the obtained cells is stable and suitable for further study on bone metabolic diseases.

isolation and culture method;osteoclast;bone marrow monocyte;differentiation;bone metabolic disease

Q813.11

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.001

1005-8982（2017）18-0001-06

2017-03-17

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No：81473692）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（No：BK20151007）

馬勇，E-mail：zhongyi-my@263.net；Tel-13505153212