詹紅偉 王倩 移植 張蕾 張娟 李燕香 耿彬 吳萌 夏亞一* 姜金*

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,甘肅 蘭州 730030

2.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730030

骨細胞占骨組織細胞總量的90%以上,是骨骼中主要的機械應(yīng)力感受細胞[1]。骨細胞具備多種生理功能,其中包括協(xié)調(diào)成骨細胞和破骨細胞的重塑、機械傳導(dǎo)、礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、與除骨骼以外器官的相互作用等[2-3]。骨細胞還可直接重塑骨骼的細胞外基質(zhì)骨,為骨骼結(jié)構(gòu)和功能的維護和調(diào)控提供必要的支持[4]。骨細胞之間通過樹突連接相互聯(lián)系,并分布在充滿液體的腔隙網(wǎng)絡(luò)中,該網(wǎng)絡(luò)遍布整個礦化的骨組織,機體在運動時,骨細胞的樹突狀結(jié)構(gòu)能感受到周圍液體所產(chǎn)生的流體剪切力(fluid shear stress,FSS)[5]。除了響應(yīng)FSS外,骨細胞還能直接感知細胞外基質(zhì)應(yīng)變力的變化,這也是骨細胞感受機械刺激的另一個重要方式[6]。研究表明,生理上的機械應(yīng)力刺激可以降低骨細胞的凋亡水平,并促進其分化[7-10]。此外,骨細胞在機械應(yīng)力刺激下可以通過直接或間接的方式調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的分化程度,從而參與骨重塑過程[11-16]。為了明確機械應(yīng)力下骨細胞行為變化及其對其他類型細胞影響的具體作用機制,本文從骨細胞分化、凋亡及其與成骨細胞和破骨細胞的相互作用等方面對機械應(yīng)力下骨細胞行為的研究進展進行綜述,為今后骨質(zhì)疏松基礎(chǔ)研究提供理論參考。

1 機械應(yīng)力對骨細胞分化的影響

1.1 骨細胞的分化過程

骨細胞是成骨細胞譜系中分化程度最高的細胞。成骨細胞來源于骨髓間充質(zhì)干細胞,后者也可以分化成脂肪細胞和成軟骨細胞。骨膜中的骨祖細胞分化為成骨細胞,有5%～20%的成骨細胞最終分化為骨細胞,而其余的成骨細胞會因細胞凋亡或逐漸扁平化成為骨襯細胞,分布在骨表面,如圖1所示[17]。在骨細胞形成的過程中,成骨細胞的形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐怨羌毎麨樘卣鞯臉渫粻?這一過程還伴隨著自噬介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)面積和線粒體數(shù)量的減少,以及胞漿突起的形成[18]。這些長的細胞質(zhì)突起穿過骨質(zhì)中的小管道,使骨細胞之間可以相互作用,并分泌因子影響鄰近的骨細胞和骨表面或骨髓中的其他細胞。與此同時,轉(zhuǎn)錄和翻譯上的重大變化使骨細胞中調(diào)控骨平衡的分子得以表達[19]。研究已經(jīng)證實不同基因負責(zé)細胞形態(tài)和骨小管網(wǎng)絡(luò)的形成,例如,E11蛋白是骨細胞啟動樹突形成的關(guān)鍵分子[20];牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1表達則對牙齒的成熟至關(guān)重要[21]。

圖1 機械應(yīng)力調(diào)控骨細胞分化過程示意圖Fig.1 Diagram depicting the regulation of osteocyte differentiation by mechanical stress

1.2 機械應(yīng)力下影響分化的分子機制

Zhang等[10]利用3D生物打印技術(shù)制備了含有人骨髓間充質(zhì)干細胞的石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu),并施加機械載荷,培養(yǎng)8周后形成了具有骨細胞特征的類器官。該研究發(fā)現(xiàn),在機械刺激作用下,在第9～31 d,類器官內(nèi)樹突狀細胞的比例和長度逐漸增加,并顯著高于對照組。這表明長期機械載荷能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞向骨細胞分化。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是機械載荷影響骨重建和吸收過程中的關(guān)鍵因子,它可以介導(dǎo)成骨細胞的礦化和破骨細胞分化[22](圖1)。Wilmoth等[23]開發(fā)了一種新型3D水凝膠雙層復(fù)合材料來模擬骨細胞生態(tài)位中的生理應(yīng)力水平,并在其上培養(yǎng)IDG-SW3前體骨細胞。并發(fā)現(xiàn),在PGE2干預(yù)下,骨細胞成熟標(biāo)志物的骨硬化蛋白(sclerostin,Sost)表達顯著增高,進展為更成熟的表型。這說明PGE2可以通過自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)骨細胞在機械應(yīng)力下的分化水平[9]。另一項研究發(fā)現(xiàn),與去雌激素組相比,雌激素處理組骨細胞在流體剪切力作用下分泌的NO和PGE2水平升高,并且Sost和骨鈣素表達也增加,這些結(jié)果提示雌激素參與調(diào)節(jié)骨細胞對機械應(yīng)力刺激的敏感性[24]。骨細胞在受到機械應(yīng)力刺激后,通過分泌PGE2和NO等信號分子來促進前體骨細胞的分化成熟,如圖1所示。然而,有關(guān)其細胞內(nèi)下游分子和信號通路的調(diào)控機制尚未得到充分報道,這為進一步研究提供了新的研究方向。

2 機械應(yīng)力對骨細胞凋亡的影響

骨細胞凋亡是骨重塑過程中的一種生理現(xiàn)象,有利于去除死骨組織,實現(xiàn)骨細胞自我更新和維持骨質(zhì)量[25]。然而,多種病理狀態(tài)的發(fā)生和發(fā)展,可能會導(dǎo)致骨細胞凋亡失衡,如衰老、廢用、糖皮質(zhì)激素過量以及性腺激素缺乏等[26-28]。

骨細胞凋亡和機械刺激之間存在著“U”型關(guān)系[7]。機械刺激過弱或過強都會引起更多的骨細胞凋亡,而適度的機械應(yīng)力刺激則可以降低骨細胞凋亡水平。有實驗顯示,在應(yīng)力達到3 000～4 000微應(yīng)變的峰值時,使用短時間應(yīng)力刺激的骨細胞凋亡比率比無應(yīng)力組減少了40%[8]。此外,在嚙齒動物太空飛行模型中,機械卸載會促進骨細胞衰老和凋亡,這可能是導(dǎo)致機械卸載引起的骨代謝失衡的主要原因[29]。在機械卸載模型中,小鼠骨小梁和骨皮質(zhì)的骨細胞凋亡及其導(dǎo)致的骨量流失均顯著增加,這提示骨細胞凋亡在調(diào)節(jié)骨架對機械負荷變化適應(yīng)性過程中發(fā)揮重要作用[30]。值得注意的是,骨細胞凋亡主要發(fā)生在骨皮質(zhì)內(nèi)表面附近,而靠近骨膜表面的骨細胞凋亡水平變化并不顯著,這可能與皮質(zhì)內(nèi)表面附近的骨細胞對維持細胞活性所需生長因子的需求量更大有關(guān)[31]。

Tan等[32]將FSS作用于骨細胞,發(fā)現(xiàn)骨細胞內(nèi)NO生成增加,并抑制了骨細胞凋亡,提示NO是FSS抑制骨細胞凋亡的重要介質(zhì)。此外,整合素、Src激酶和ERK也是FSS下維持骨細胞活性的重要信號分子[33]。Kitase等[34]發(fā)現(xiàn)機械應(yīng)力下骨細胞產(chǎn)生的PGE2也能保護其本身的活性,進一步證實PGE2通過EP2受體和EP4受體激活cAMP/PKA和PI3K/AKT信號通路,抑制GSK-3活性,促進β-catenin核轉(zhuǎn)位和表達,從而對骨細胞起到保護作用。還有學(xué)者認為鑲嵌在骨細胞上的整合素能感應(yīng)生態(tài)位的FSS,并將機械信號傳導(dǎo)至細胞質(zhì)以防止細胞凋亡[30]。

細胞間隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是骨細胞機械信號傳導(dǎo)中的“質(zhì)量檢查點”,對維持其機械敏感性至關(guān)重要。FGF7可上調(diào)Cx43的表達,并促進β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)聚集和部分核轉(zhuǎn)位,從而維持骨細胞活性[35]。為保證骨細胞獲得充足營養(yǎng)和氧氣交換,其需要完整的腔隙-小管網(wǎng)絡(luò)。然而,在機械卸載期間,腔隙-小管網(wǎng)絡(luò)可能遭到破壞,導(dǎo)致骨細胞缺氧[36]。因此,有學(xué)者認為缺氧是機械卸載下骨細胞凋亡的另一個重要原因。缺氧會引起線粒體ATP減少、ROS增加和胞內(nèi)pH降低等一系列變化,從而對細胞造成損傷并引發(fā)細胞凋亡[37]。生理狀態(tài)下FSS在骨細胞周圍產(chǎn)生流動,促進氧氣擴散,從而抑制缺氧引起的細胞凋亡。Montesi等[38]發(fā)現(xiàn)在低氧條件下,骨細胞內(nèi)氧調(diào)節(jié)蛋白150(ORP150)表達水平顯著升高,并推測ORP150可能對低氧條件下的骨細胞具有保護作用。另有研究顯示,在缺氧期間,腺病毒E1B19 kDa互作蛋白也呈現(xiàn)高表達狀態(tài),但其在骨細胞凋亡中的具體作用有待進一步研究[39]。

研究表明鳶尾素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)也參與了機械應(yīng)力下骨細胞凋亡的調(diào)控。Storlino等[30]發(fā)現(xiàn),在老齡和失重小鼠模型中,鳶尾素能夠通過抑制氧化應(yīng)激和糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)來降低骨細胞凋亡,并增加皮質(zhì)骨中存活骨細胞的數(shù)量。Wang等[40]發(fā)現(xiàn),在地塞米松誘導(dǎo)的骨細胞凋亡模型中,機械刺激能夠上調(diào)骨細胞內(nèi)BMP-7表達來降低凋亡水平,并證實BMP-7抗凋亡作用主要通過其受體BMPR2介導(dǎo),可能與PI3K/AKT/GSK3b信號通路的激活有關(guān)。骨細胞凋亡在骨代謝中扮演著重要的角色。機械刺激通過作用于骨細胞膜表面的整合素和Cx43,以及促進骨細胞分泌PGE2和BMP-7的方式,將機械信號轉(zhuǎn)化為生物信號。隨后,這些信號通過細胞內(nèi)的ERK、cAMP/PKA和PI3K/AKT等信號通路介導(dǎo),發(fā)揮對細胞凋亡的抑制作用,進而維持骨代謝平衡,見圖2。

圖2 機械應(yīng)力調(diào)控骨細胞凋亡示意圖Fig.2 Diagram depicting the regulation of osteocyte apoptosis by mechanical stress

3 機械應(yīng)力下骨細胞與其他類型細胞的相互作用

骨細胞通過多種細胞傳感器,包括初級纖毛、整合素、離子通道和縫隙連接等,感受機械刺激,被激活后釋放生物信號,從而調(diào)控效應(yīng)細胞的生物學(xué)行為。在機械應(yīng)力下,骨細胞能夠直接或間接地促進成骨細胞的分化,并抑制破骨細胞的分化。另外,骨細胞也能通過分泌細胞外囊泡的方式,有效地招募骨髓間充質(zhì)干細胞并促進其成骨分化[41]?？傊?骨細胞在機械應(yīng)力下與成骨細胞和破骨細胞等相互作用中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。

3.1 骨細胞與成骨細胞的偶聯(lián)機制

成骨細胞的生長和定向分化受到多步驟的分子通路控制,其中不同的轉(zhuǎn)錄因子和信號蛋白對其分化起到重要的調(diào)控作用[42]。在機械應(yīng)力下,骨細胞感應(yīng)機械刺激并向成骨細胞發(fā)出信號,調(diào)節(jié)其分化程度。Cx43介導(dǎo)的縫隙連接是骨細胞直接調(diào)控成骨細胞的重要機制,通過縫隙連接骨細胞向成骨細胞發(fā)出信號,提高其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性從而促進其分化。除此之外,骨細胞通過調(diào)控IL-6[12]、IL-11[11]、整合素α5[43]和PGE2[43]等的分泌來間接調(diào)控成骨細胞分化水平,見圖3。

圖3 機械應(yīng)力介導(dǎo)骨細胞調(diào)控成骨細胞分化示意圖Fig.3 Diagram depicting the regulation of osteoblast differentiation in osteocyte mediated by mechanical stress

Cx43已被證明在骨形成和動態(tài)平衡中扮演許多重要的角色,包括調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化和凋亡[44]。ALP是成骨細胞分化時分泌的一種糖蛋白酶,因此是成骨細胞分化的重要標(biāo)志物。Taylor等[45]通過建立一種體外三維共培養(yǎng)系統(tǒng)(骨細胞-成骨細胞),證明了機械應(yīng)力下骨細胞通過縫隙連接將生物信號傳遞給成骨細胞的能力。他們發(fā)現(xiàn),在暴露于FSS下的骨細胞中,縫隙連接在骨細胞和成骨細胞之間形成,且成骨細胞的ALP活性顯著增加,從而促進了成骨細胞的分化。Yvanoff等[46]開發(fā)了一種基于活細胞的微流控平臺,研究了骨細胞和成骨細胞之間通過Cx43介導(dǎo)的縫隙連接的細胞間通訊。他們發(fā)現(xiàn)高分辨率熒光顯微鏡顯示在成骨細胞和骨細胞之間接觸處存在Cx43蛋白。暴露在微流體通道中的FSS會導(dǎo)致鈣波響應(yīng)從骨細胞傳播到鄰近的成骨細胞,從而促進了成骨細胞的分化。此外,他們還發(fā)現(xiàn)加入縫隙連接抑制劑(18β-甘草次酸)可以消除鈣波從骨細胞向周圍成骨細胞的傳播[46]。Loiselle等[47]的研究結(jié)果同樣表明,Cx43在骨細胞和成骨細胞之間的形成,并介導(dǎo)機械應(yīng)力下骨細胞對成骨細胞分化的促進作用。

機械負荷會刺激骨細胞釋放多種合成代謝信號,包括細胞因子、PGE2和整合素等,以誘導(dǎo)成骨細胞的分化。Hao等[12]發(fā)現(xiàn),壓縮循環(huán)力下MLO-Y4骨細胞可以產(chǎn)生IL-6,通過STAT3和ERK信號通路來調(diào)節(jié)小鼠顱骨成骨細胞的ALP活性,進而影響成骨細胞的分化。Dong等[11]研究發(fā)現(xiàn),在機械應(yīng)力下,IL-11可通過激活I(lǐng)L-11Rα-STAT1/3來增強Wnt信號的級聯(lián)作用,從而促進成骨細胞的分化,有利于骨形成。此外,Zhao等[43]觀察到,在機械應(yīng)力下整合素α5是脛骨成骨反應(yīng)的必需因素,其中機制可能是骨細胞細胞膜上的整合素α5通過Cx-43半通道釋放PGE2,進而減少Sost蛋白,且增加β-catenin在成骨細胞中的表達,從而參與機械負荷下的成骨反應(yīng)。Matsuzaka等[48]使用一種新型可控FSS刺激成骨細胞-骨細胞共培養(yǎng)裝置,發(fā)現(xiàn)在不同水平FSS下,骨細胞可以通過增加PGE2的分泌來調(diào)節(jié)成骨細胞的排列,并通過高度排列的骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)骨組織的功能化。同時,Matsuzaka等[48]也發(fā)現(xiàn),拮抗成骨細胞上PGE2的EP2和EP4受體可導(dǎo)致定向膠原基質(zhì)上成骨細胞排列的喪失。

3.2 骨細胞與破骨細胞的偶聯(lián)機制

破骨細胞是起源于單核巨噬細胞系的多核細胞,它是人體唯一能夠明確降解骨的細胞,負責(zé)在舊骨區(qū)域分泌酸性物質(zhì)、溶解骨中的礦物質(zhì),并分泌蛋白酶來消化骨基質(zhì)。在機械應(yīng)力下,破骨細胞的活動主要受到骨細胞的調(diào)控。其中,核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是調(diào)控破骨細胞分化的重要分子[49]。當(dāng)骨細胞受到機械應(yīng)力刺激后,通過降低RANKL/OPG比率來抑制破骨細胞的分化。此外,骨細胞還能通過調(diào)節(jié)細胞因子及信號分子的分泌來調(diào)控破骨細胞的分化,例如CXCL5[15]、IL-6[15]、NO[16]、MEPE[14]等,見圖4。

圖4 機械應(yīng)力介導(dǎo)骨細胞調(diào)控破骨細胞分化示意圖Fig.4 Diagram depicting the regulation of osteoclast differentiation in osteocyte mediated by mechanical stress

骨細胞產(chǎn)生的RANKL在破骨細胞的分化過程中起主要調(diào)節(jié)作用。RANKL以膜結(jié)合的形式通過骨細胞樹突狀突起延伸到骨表面并進入骨髓和骨膜間,從而提供給破骨細胞前體細胞。進一步結(jié)合到破骨細胞前體表面的RANK上,刺激破骨細胞前體向破骨細胞表型轉(zhuǎn)化,使破骨細胞成熟[50]。研究發(fā)現(xiàn),在骨重建過程中,未受機械刺激的骨細胞為破骨細胞和破骨細胞前體細胞提供了一個有利于其增殖分化的環(huán)境,從而引導(dǎo)骨吸收沿著骨的負荷軸方向進行,而受到機械應(yīng)力刺激的骨細胞則會減少RANKL的表達,從而抑制破骨細胞的分化[49]。Xu等[51]使用自主研發(fā)的微流控共培養(yǎng)平臺研究骨細胞在不同水平FSS對破骨細胞分化的影響,發(fā)現(xiàn)與低水平FSS(0.5 Pa和1 Pa)刺激相比,在骨細胞受到2 Pa FSS刺激的小室中,分化的破骨細胞數(shù)量顯著減少。骨細胞來源的OPG對于RANKL在骨細胞中的運輸和隨后的調(diào)節(jié)破骨細胞的功能是必需的。研究表明,在機械負荷下,MLO-Y4骨細胞的OPG蛋白的表達也發(fā)生了變化。Kulkarni等[14]使用脈沖流體力學(xué)加載骨細胞1 h后,對RANKL/OPG比值的變化進行了評估。他們發(fā)現(xiàn)在機械應(yīng)力下,骨細胞可以通過分泌可溶性因子MEPE來促進自身OPG的分泌,從而抑制破骨細胞分化。Takayanagi等[52]進一步研究得出RANKL通過轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 來調(diào)控破骨細胞的最終分化。

在機械應(yīng)力下的骨細胞也能分泌細胞因子及信號分子來調(diào)控破骨細胞的分化。Pathak等[53]對人原代骨細胞用10%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)血清或健康對照血清處理7 d,之后對其用脈沖流體力學(xué)施加1 h,發(fā)現(xiàn)RA血清可使RANKL/OPG表達比例增加3.4倍,顯著促進了破骨細胞的分化,而機械負荷可以抵消這一作用。這表明機械應(yīng)力可能阻止炎癥驅(qū)動的骨細胞介導(dǎo)的RA內(nèi)破骨細胞形成。他們還觀察到,在機械應(yīng)力下,正常血清處理的骨細胞在60 min內(nèi)NO產(chǎn)生的總量增加了3.5倍。這一現(xiàn)象表明,骨細胞在受到機械應(yīng)力刺激后,可能通過分泌大量的NO來抑制破骨細胞的分化。Tan等[16]同樣發(fā)現(xiàn),通過機械應(yīng)力作用的骨細胞釋放可溶性因子可調(diào)節(jié)破骨細胞的生成,且此作用至少部分依賴于機械應(yīng)力對骨細胞內(nèi)NO釋放通路的激活。Lau等[54]發(fā)現(xiàn)在低強度高頻振動下,骨細胞通過分泌可溶性因子抑制破骨細胞的數(shù)量和大小。同時,振動的骨細胞分泌的RANKL顯著減少,這提示RANKL可能參與了低強度高頻振動對破骨細胞分化的抑制作用。此外,Tirado-Cabrera等[15]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析和中和實驗表明,機械應(yīng)力刺激的骨細胞通過減少CXCL5的分泌來抑制破骨細胞的募集和分化。另外,他們還發(fā)現(xiàn),在機械應(yīng)力下,骨細胞可以通過激活PTH1R來降低IL-6的分泌,從而抑制破骨細胞的分化。然而,另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)壓縮循環(huán)力下骨細胞通過增加IL-6的分泌來抑制破骨細胞分化[12]。

4 總結(jié)與展望

機械應(yīng)力通過促進骨細胞分化和抑制凋亡的方式參與骨重塑過程。此外,受機械應(yīng)力刺激的骨細胞通過直接或間接的方式促進成骨細胞分化,同時抑制破骨細胞分化,從而在骨代謝的生理或病理過程中發(fā)揮重要作用。盡管在體外研究中已經(jīng)得到了大量關(guān)于機械應(yīng)力下骨細胞生物學(xué)行為變化的證據(jù),但為了進一步闡明這些變化在機械應(yīng)力下的骨穩(wěn)態(tài)中的作用,還需要開展更多以動物模型為基礎(chǔ)的體內(nèi)研究。此外,機械應(yīng)力的刺激方式有多種形式,例如FSS、持續(xù)靜壓力、牽張力、微重力等。目前的研究主要集中在FSS上,未來的研究應(yīng)該擴展到其他機械應(yīng)力刺激方式,以更全面地了解機械應(yīng)力對骨細胞生物學(xué)行為變化的機制,這將為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松提供堅實的理論基礎(chǔ)。