趙麗艷 張秀云 苗春生 李相軍 李 才 劉昕鳴
(吉林大學第二醫(yī)院檢驗科,吉林 長春 130041)
人參糖肽對大鼠體外胰島β細胞的保護作用
趙麗艷 張秀云1苗春生1李相軍1李 才1劉昕鳴
(吉林大學第二醫(yī)院檢驗科,吉林 長春 130041)
目的 探討人參糖肽對體外培養(yǎng)大鼠胰島β細胞的保護效果。方法 分離和培養(yǎng)大鼠胰島β細胞。人參糖肽預處理β細胞之后用鏈脲佐菌素(STZ)引起細胞損傷(人參糖肽+STZ組),STZ引起β細胞損傷后再進行人參糖肽處理(STZ+人參糖肽組),以正常胰島β細胞和單用人參糖肽處理的β細胞作為對照。檢測培養(yǎng)上清中胰島素和C肽分泌水平,噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率,免疫組織化學染色測量β細胞內(nèi)胰島素蛋白表達水平,電鏡觀察細胞超微結構變化。結果 人參糖肽+STZ組胰島β細胞的胰島素和C肽分泌量與正常胰島細胞比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而在STZ+人參糖肽組二者分泌量均明顯減少(P<0.05)。人參糖肽+STZ組胰島β細胞的存活率有所下降,但與單獨人參糖肽組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而STZ+人參糖肽組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。免疫組織化學定量研究顯示,STZ+人參糖肽組胰島β細胞內(nèi)胰島素陽性染色面積與細胞面積的百分比明顯小于其他3組。STZ+人參糖肽組胰島β細胞超微結構為變性及壞死性改變,且分泌顆粒極少,而人參糖肽+STZ組胰島β細胞這些改變明顯減輕,可見大量分泌顆粒。結論 人參糖肽對STZ引起的大鼠體外胰島β細胞損傷有防護作用。
人參糖肽;胰島β細胞;胰島素
人參糖肽是我國治療糖尿病(DM)的中藥二類新藥。研究證明,人參糖肽能降低實驗性DM動物的血糖水平〔1〕。應用人參糖肽治療2型糖尿病(T2DM)患者,其降低血糖起效較緩慢,但作用持續(xù),停藥后一段時間內(nèi)血糖仍處于較低水平〔2〕。人參糖肽降低血糖作用的機制尚未闡明。胰島β細胞的主要功能是分泌胰島素,胰島素對維持機體糖穩(wěn)態(tài)起關鍵作用,在DM的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。人參糖肽能否通過保護胰島β細胞功能發(fā)揮降低血糖的作用,目前尚未見報道。本研究旨在探討人參糖肽對體外培養(yǎng)大鼠胰島β細胞的保護效果。
1.1 材料 人參糖肽注射液由吉林省松原天實藥業(yè)有限責任公司提供,使用時用生理鹽水配制成所需濃度。鏈脲佐菌素(STZ)、胰島素抗體、膠原酶Ⅴ、細胞分離液Histopaque1077、雙硫腙、噻唑藍(MTT)購自Sigma公司;RPMI- 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;胰島素和C肽放射免疫分析試劑盒購自中國原子能科學研究院同位素研究所;其他試劑為國產(chǎn)分析純;濃縮型鏈霉素親和素- 生物素復合物(SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及其他組化試劑購自博士德公司。體重250~300 g雄性Wistar大鼠由吉林大學實驗動物部提供(實驗動物合格證號吉科字950000010,醫(yī)動字10- 5110)。
1.2 胰島β細胞的分離和培養(yǎng) 參考文獻〔3〕的方法并加以改進。大鼠過夜禁食,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,無菌條件下剪開腹壁,上翻肝臟,下拉十二指腸,分離膽總管十二指腸入口處,引入手術線,近肝門部結扎膽總管上端,膽總管中段向遠側插入4.5號針頭,準確插入后可見黃綠色膽汁回流,心臟放血處死大鼠。經(jīng)膽總管逆行注入預冷Hank液,再灌注膠原酶Ⅴ(1 mg/ml)6 ml。灌注后迅速剪下膨脹的胰腺,將其放入預熱至37℃的水浴中溫育,靜止消化12 min。用力振蕩胰腺消化產(chǎn)物,經(jīng)600 μm濾網(wǎng)過濾除去未完全消化的組織,終止消化,4℃ 1 000 r/min離心 2 min。將胰島消化產(chǎn)物混于分離液Histopaque1077中,再沿管壁在混合產(chǎn)物之上緩慢加入10 ml Histopaque1077,繼而加入10 ml冷Hank液,梯度離心收集純化胰島。雙硫腙染色倒置顯微鏡下觀察染成猩紅色的細胞團即為胰島〔4〕。調(diào)整細胞濃度為2×105/ml,置于6孔培養(yǎng)板中,用含10%FBS、青霉素100 U/ml、鏈霉素0.1 mg/ml的RPMI- 1640培養(yǎng)基于5% CO2、37℃培養(yǎng)5 d后用于下述實驗。
1.3 胰島β細胞處理、胰島素和C肽分泌量測定 ①人參糖肽+STZ組:在含等量胰島β細胞的培養(yǎng)液中加入終濃度160 μg/ml的人參糖肽,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再加入STZ(5 mmol/L)作用2 h后收集培養(yǎng)上清,按放射免疫分析試劑盒說明書測定胰島素和C肽分泌量;②STZ+人參糖肽組:在含等量胰島β細胞的培養(yǎng)液中先加入STZ(5 mmol/L)作用2 h后再加入人參糖肽160 μg/ml,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)上清,按放射免疫分析試劑盒說明書測定胰島素和C肽分泌量。以正常胰島β細胞和單獨用人參糖肽處理的β細胞為對照。每組3個平行孔。
1.4 胰島β細胞存活率的檢測 96孔培養(yǎng)板每孔加入混勻的β細胞懸液190 μl(含10 000個細胞)。經(jīng)上述因素處理并培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),充分振蕩。設置調(diào)零孔和空白對照孔。以空白對照孔調(diào)零,用酶標儀在570 nm波長測定每孔的A值。每種條件6個平行孔。計算細胞存活率,細胞存活率=(實驗孔A值-空白對照A值)/(對照孔A值-空白對照A值)×100%。
1.5 免疫細胞化學染色 上述胰島β細胞處理后在6孔板制備細胞爬片,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,冰丙酮固定15 min,空氣干燥,PBS清洗,0.5%Triton X- 100孵育20 min,PBS清洗,3%H2O2室溫孵育15 min,PBS清洗3次,封閉血清封閉后,滴加胰島素一抗(1∶200),4℃過夜,以PBS代替一抗作為陰性對照。PBS漂洗,滴加二抗37℃孵育30 min,PBS漂洗,加入SABC 37℃孵育20 min,DAB顯色。蘇木素復染,脫水,透明,中性樹脂封片。光鏡觀察反應產(chǎn)物呈棕褐色為陽性反應。利用Imagepro Plus 6.0分析軟件測定每個細胞胰島素陽性染色的面積和細胞總面積,計算二者百分比,表示胰島素蛋白表達水平。每組測量30個細胞。
1.6 胰島β細胞電鏡觀察 將上述1.3中經(jīng)過不同處理的胰島β細胞刮下,懸浮在培養(yǎng)液中,傾入尖底離心管,800 r/min離心10 min,吸除上清液,緩慢加入2.5%戊二醛固定液,800 r/min離心10 min,使細胞成小丸狀,在含2.5%戊二醛固定液中切成1 mm3小塊,用2.5%戊二醛前固定和1%鋨酸后固定,Epon 812包埋,LKB- V型超薄切片機制備超薄切片,鈾和鉛雙重染色,JEM- 1200EX透射電鏡觀察胰島細胞超微結構并攝片。
1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析、χ2檢驗。
2.1 胰島素和C肽分泌量 與正常胰島β細胞組相比,單獨人參糖肽處理β細胞24 h,對胰島素的分泌量無顯著影響。人參糖肽+STZ組胰島β細胞,其胰島素分泌量與正常胰島β細胞組及單獨人參糖肽處理組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但STZ+人參糖肽組胰島素分泌量顯著低于其他3組(P<0.05)。C肽分泌量與胰島素分泌量基本一致。見表1。
2.2 胰島β細胞存活率的檢測結果 與正常胰島β細胞組相比,單獨人參糖肽組仍然很高,可達(96.8±18.6)%,表明人參糖肽對胰島β細胞無明顯細胞毒性。人參糖肽+STZ組,細胞存活率有所下降,但與單獨人參糖肽組比較無統(tǒng)計學意義。STZ+人參糖肽組細胞存活率顯著低于其他3組(P<0.05)。見表1。
表1 各組胰島β細胞的胰島素、C肽分泌量和細胞存活率
與STZ+人參糖肽組比較:1)P<0.05
2.3 免疫細胞化學染色結果 培養(yǎng)5 d的胰島β細胞呈球形或略呈橢圓形,直徑10~14 μm,胞質透亮,胞核大。免疫細胞化學染色顯示:正常胰島β細胞呈橢圓形或短梭形,核圓而大,細胞結構無明顯異常,在胞質內(nèi)可見胰島素呈濃重棕黃色陽性表達,證明所分離和培養(yǎng)的細胞是胰島β細胞。單獨加入人參糖肽對胰島β細胞結構無明顯影響,胞核呈圓形,胞質內(nèi)可見胰島素呈棕黃色陽性表達。人參糖肽+STZ組胞核呈圓形,胞質呈棕色,可見少量空泡。STZ+人參糖肽組核膜界限模糊,部分胞膜破壞,胞漿內(nèi)可見多數(shù)空泡,胞質呈淺淡黃色。STZ+人參糖肽組胰島β細胞內(nèi)胰島素陽性染色面積與細胞面積的百分比(38.8±8.2)%明顯小于正常胰島β細胞組(89.9±24.2)%、單獨人參糖肽組(86.6±17.8)%和人參糖肽+STZ組(76.4±18.6)%(P<0.05)。見圖1。
圖1 各組胰島β細胞免疫細胞化學染色(×400)
2.4 胰島β細胞超微結構改變 正常胰島β細胞:胞核較規(guī)則,核膜光滑,染色質均勻分布,內(nèi)質網(wǎng)豐富,胞質內(nèi)可見大量高密度的分泌顆粒。人參糖肽+STZ組:胞核較規(guī)則,胞核內(nèi)染色質邊聚不明顯,線粒體較多,胞質內(nèi)可見較多分泌顆粒。STZ+人參糖肽組:呈變性和壞死性改變,胞核染色質濃集邊聚,細胞器溶解,可見大小不一的空泡,胞質內(nèi)分泌顆粒稀少,見圖2。
A:正常胰島β細胞(×8 000);B:人參糖肽+STZ(×6 600);C:STZ+人參糖肽(×8 000)圖2 各組胰島β細胞超微結構改變
胰島β細胞是體內(nèi)分泌胰島素的重要細胞,在DM的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用,保護胰島β細胞具有重要意義。研究胰島β細胞功能可以利用胰島素瘤細胞如NIT- 1β、MIN6N8、RIN- m5f、INS- 1細胞,也可利用從動物胰腺分離培養(yǎng)的胰島β細胞〔5,6〕,本研究利用從大鼠胰腺組織分離培養(yǎng)的胰島β細胞。STZ對胰島β細胞具有高度選擇性毒性,除了用來復制DM動物模型外,目前已用于體外引起胰島β細胞損傷〔7〕,本研究利用STZ作為損傷胰島β細胞的因素。C肽與胰島素以等分子數(shù)從胰島β細胞釋放,具有穩(wěn)定性好、不受外源性胰島素和血胰島素抗體的影響等特點,已成為胰島素分泌能力的一個良好指標。本研究表明人參糖肽預處理對胰島β細胞有較好的保護作用。但人參糖肽后處理對胰島β細胞的保護作用不明顯。
細胞存活率可以反映損傷因素對細胞的損害程度。本研究結果表明,人參糖肽預處理能顯著減輕STZ對胰島β細胞的損傷,對細胞有較好的保護作用。然而,人參糖肽后處理不能明顯保護胰島β細胞。本研究免疫細胞化學染色證明所分離和培養(yǎng)的細胞是胰島β細胞。從細胞形態(tài)改變和胰島素陽性染色面積與細胞面積的百分比分析可見,人參糖肽預處理對胰島β細胞損傷有較好的保護作用,而人參糖肽后處理則保護作用較差。胰島β細胞超微結構改變進一步說明人參糖肽預處理對胰島β細胞損傷有較好的保護作用。
由于胰腺β細胞中的抗氧化酶活性很低,對氧化應激更為敏感,活性氧不僅可以直接損傷胰島β細胞,還可影響胰島素合成和分泌的信號轉導通路,導致β細胞凋亡,損害胰島分泌功能。研究表明,氧化應激在1型和T2DM胰島β細胞功能不全的發(fā)生機制中起重要作用〔8〕。目前人參糖肽保護胰島β細胞的機制尚不十分清楚。研究證明,人參糖肽對蛋白質糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的形成具有明顯抑制作用〔9〕,還能明顯改善DM大鼠體內(nèi)蓄積AGEs的致尾腱膠原交聯(lián)〔10〕。Lin等〔11〕研究證明,AGEs通過氧化應激引起胰島β細胞損傷。還有研究顯示,人參通過減少氧化應激減輕環(huán)孢素引起的胰島β細胞損傷〔12〕。因此認為人參糖肽可能通過其抗氧化應激作用對胰腺β細胞發(fā)揮保護作用。
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〔2017- 05- 10修回〕
(編輯 滕欣航)
吉林省科學技術廳資助項目(No.20010545)
劉昕鳴(1961- ),女,副教授,主要從事內(nèi)分泌代謝疾病臨床生化研究。
趙麗艷(1971- ),女,博士,副教授,主要從事代謝性疾病和抗病生物學研究。
R965,R587.1
A
1005- 9202(2017)15- 3667- 03;
10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.011
1 吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室