張 濤 劉 磊 姜旭勉

(武漢市中心醫(yī)院胃腸外科,湖北 武漢 430000)

結(jié)直腸癌患者膳食纖維攝入情況對(duì)腸道菌群的影響

張 濤 劉 磊 姜旭勉

(武漢市中心醫(yī)院胃腸外科,湖北 武漢 430000)

目的 探討結(jié)直腸癌患者膳食纖維的攝入對(duì)腸道菌群的影響。方法 280例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，并選取參與體檢的290例健康人群作為對(duì)照組；采用自行設(shè)計(jì)的調(diào)查問(wèn)卷調(diào)查受試者基本情況及膳食纖維攝入情況。收集兩組研究對(duì)象糞便，提取糞便DNA，采用熒光定量PCR方法測(cè)定受試者腸道菌群水平，分析腸道菌群與大腸癌發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果 除谷類與海鮮，結(jié)直腸癌組蔬菜、水果、豆類的攝入均明顯低于對(duì)照組(均P<0.05)，肉類的攝入明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，總膳食纖維的攝入明顯低于對(duì)照組研究對(duì)象(P<0.05)。結(jié)直腸癌患者乳酸桿菌、雙歧桿菌明顯減少(P<0.05)，大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、擬桿菌屬、脆弱擬桿菌、單形擬桿菌、多形擬桿菌、吉氏擬桿菌、普通擬桿菌、梭桿菌屬、梭菌屬、肉毒梭菌、艱難梭菌明顯增多(均P<0.05)。在結(jié)直腸癌組中，除脆弱擬桿菌、單形擬桿菌外，在對(duì)照組中，除吉氏擬桿菌外高膳食纖維亞組與低膳食纖維亞組的各菌群水平均有差異(均P<0.05)；在高膳食纖維亞組，結(jié)直腸癌患者與對(duì)照組研究對(duì)象各菌群水平均有差異(均P<0.05)。結(jié)直腸癌組與對(duì)照組乳酸桿菌、雙歧桿菌與膳食纖維水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，糞腸球菌、屎腸球菌、普通擬桿菌、梭桿菌屬、梭菌屬、肉毒梭菌、艱難梭菌與膳食纖維水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸癌患者膳食纖維的攝入情況影響腸道菌群水平。

結(jié)直腸癌；膳食纖維；腸道菌群

結(jié)直腸癌是下消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均較高〔1〕。腸道菌群對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失衡在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，研究表明，膳食纖維是結(jié)直腸癌的保護(hù)性因素〔2，3〕。但關(guān)于膳食纖維的攝入與腸道菌群的相互作用及對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展影響的研究還未報(bào)道。因此，本研究擬探討結(jié)直腸癌患者膳食纖維的攝入與腸道菌群的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 結(jié)直腸癌組 選取2015年1月至2016年6月280例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：新發(fā)患者；符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)電子結(jié)腸鏡及病理診斷確診；無(wú)結(jié)直腸癌家族史，無(wú)結(jié)直腸手術(shù)史；身體狀況良好，不合并心、肝、腎、血液系統(tǒng)疾?。粺o(wú)精神神經(jīng)疾病及認(rèn)知障礙，意識(shí)清楚，能夠完成問(wèn)卷調(diào)查；近3個(gè)月內(nèi)未使用抗生素，未飲用酸奶等微生態(tài)制劑；知情并同意本次調(diào)查。排除標(biāo)準(zhǔn)：未確診患者；有慢性腹瀉、炎性腸病、結(jié)腸息肉等胃腸相關(guān)疾病的患者；合并心、肝、腎、血液系統(tǒng)疾病者；有胃腸手術(shù)史者；合并精神神經(jīng)疾病，無(wú)法完成問(wèn)卷調(diào)查者；拒絕簽署知情同意書者。

1.1.2 對(duì)照組 選取同期在體檢科進(jìn)行體檢的290例健康體檢者。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)腸道疾病癥狀及消化道慢性疾病史者，常規(guī)體檢及糞便常規(guī)檢查均無(wú)異常；無(wú)結(jié)腸癌家族史；近3個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、酸奶等微生態(tài)制劑使用史；無(wú)精神神經(jīng)疾病及認(rèn)知障礙，意識(shí)清楚，能夠完成問(wèn)卷調(diào)查知情并同意本次調(diào)查。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有慢性腹瀉等慢性腸道疾病，及結(jié)腸息肉、結(jié)腸潰瘍等疾病者；有胃腸道手術(shù)史者；有交流障礙，無(wú)法完成問(wèn)卷調(diào)查者；拒絕參與本項(xiàng)研究者。

1.2 方法

1.2.1 問(wèn)卷調(diào)查 根據(jù)文獻(xiàn)〔4〕自行編制調(diào)查問(wèn)卷。問(wèn)卷內(nèi)容包括研究對(duì)象一般情況、健康相關(guān)因素及半定量食物頻率表，研究對(duì)象一般情況包括年齡、性別、身高、體重等資料；健康相關(guān)因素包括生活習(xí)慣等；半定量食物頻率包括谷類、豆及豆制品類、蔬菜類、水果類、堅(jiān)果類、肉類、奶及奶制品類、蛋類、海產(chǎn)品類等10類食品121種食物的攝入頻率及每次攝入量。膳食纖維攝入量通過(guò)中國(guó)食物成分表2004計(jì)算得到。

在本次調(diào)查前，研究員經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)，能夠解答研究對(duì)象調(diào)查過(guò)程中出現(xiàn)的各種問(wèn)題；采取面對(duì)面訪談的形式，調(diào)查完成后問(wèn)卷當(dāng)場(chǎng)回收，并復(fù)核問(wèn)卷，及時(shí)發(fā)現(xiàn)調(diào)查過(guò)程中出現(xiàn)的遺漏項(xiàng)，并及時(shí)改正。

1.2.2 糞便菌群數(shù)量測(cè)定 糞便樣本的采集：收集所有受試者新鮮大便，用天平稱取終端大便3 g。存放于無(wú)菌離心管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)，9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，核酸蛋白檢測(cè)儀、電泳儀Power PAC 3000、凝膠成像分析系統(tǒng)Gel Doc 2000TM(美國(guó)BIO- RAD公司)，熒光定量PCR儀ABI 7300(美國(guó)ABI公司)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，熒光定量PCR儀Light Cycler 2.0(瑞士羅氏公司)。實(shí)驗(yàn)試劑：DNA提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、RNA 酶抑制劑、Oligo dT18、dNTPs(中國(guó)天根公司)，Power SYBR? Green PCR Master Mix(美國(guó)ABI公司)，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker(加拿大Fermentas公司)，瓊脂糖(美國(guó) Introvergen公司)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega 公司)。其他試劑：DEPC水、乙醇、氯仿、異丙醇、氯仿- 異戊醇(24∶1)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

引物的設(shè)計(jì)與合成：參照文獻(xiàn)〔5〕設(shè)計(jì)大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、擬桿菌屬等引物，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。

糞便DNA的提取：糞便樣本預(yù)處理：取0.5 g糞便樣本，加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中充分混勻，并于超低溫離心機(jī)中離心3 min，取上清，重復(fù)離心操作3次，再取上述上清液加入EP管中，超低溫離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。糞便DNA的提取及純化：按照試劑盒說(shuō)明提取DNA，粗提取完畢后，采用DNA純化試劑盒純化DNA，然后于核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度及A260/A280純度。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA片段大小及完整性，并于凝膠成像分析系統(tǒng)觀察。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：Real- time PCR Master Mix(2×)10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，cDNA模板(300 ng)2 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)補(bǔ)足至20 μl。將反應(yīng)體系瞬時(shí)離心，上機(jī)循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火10 s，68℃延伸40個(gè)循環(huán)，74℃延伸30 s。每次試驗(yàn)均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品與陰性對(duì)照，試驗(yàn)完成后采用Light Cycler PCR儀分析糞便標(biāo)本所含細(xì)菌拷貝數(shù)的Ct值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，求得糞便樣本菌群的定量結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象一般情況及膳食纖維攝入情況 本次調(diào)查共收集結(jié)直腸癌患者280例，在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，因數(shù)據(jù)不完整、信息錯(cuò)誤、有結(jié)直腸癌家族史等原因剔除34例，最后246例患者進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組290例，其中因數(shù)據(jù)不全、信息錯(cuò)誤等原因剔除32例，最后258例納入研究。

兩組研究對(duì)象年齡、性別構(gòu)成、體力活動(dòng)、體重指數(shù)(BMI)、吸煙、飲酒等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。除谷類與海鮮，結(jié)直腸癌組蔬菜、水果、豆類的攝入均明顯低于對(duì)照組(均P<0.05)，肉類的攝入明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，總膳食纖維的攝入明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況及膳食纖維攝入比較

2.2 研究對(duì)象菌群水平比較 結(jié)直腸癌患者乳酸桿菌、雙歧桿菌明顯減少(P<0.05)；大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、擬桿菌屬、脆弱擬桿菌、單形擬桿菌、多形擬桿菌、吉氏擬桿菌、普通擬桿菌、梭桿菌屬、梭菌屬、肉毒梭菌、艱難梭菌明顯增多(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 研究對(duì)象不同水平膳食纖維攝入者腸道菌群水平分析 將膳食纖維攝入水平按照攝入量的中位數(shù)分為兩組，低于P50為低膳食纖維，高于P50為高膳食纖維，將膳食纖維分層后比較兩組腸道菌群水平。在結(jié)直腸癌組中，除脆弱擬桿菌、單形擬桿菌外，在對(duì)照組中，除吉氏擬桿菌外，高膳食纖維亞組與低膳食纖維亞組的各菌群水平均有差異(均P<0.05)；在高膳食纖維亞組，結(jié)直腸癌患者與對(duì)照組研究對(duì)象各菌群水平均有差異(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 腸道菌群與膳食纖維的相關(guān)性分析 結(jié)直腸癌組與對(duì)照組乳酸桿菌、雙歧桿菌與膳食纖維水平呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)；糞腸球菌、屎腸球菌、普通擬桿菌、梭桿菌屬、梭菌屬、肉毒梭菌、艱難梭菌與膳食纖維水平呈顯著負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 研究對(duì)象菌群水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

表3 不同水平膳食纖維腸道菌群水平分析

與結(jié)直腸癌組低膳食水平組相比：1)P<0.05；與對(duì)照組高膳食纖維水平相比：2)P<0.05；與對(duì)照組低膳食纖維水平相比：3)P<0.05

表4 腸道菌群與膳食纖維的相關(guān)性分析

3 討 論

腸道菌群失衡對(duì)腸道的致癌作用可能通過(guò)腸道菌群失衡導(dǎo)致腸道黏膜受損、引發(fā)腸道黏膜的慢性炎性反應(yīng)、腸道菌群產(chǎn)生多種生物酶及毒性代謝產(chǎn)物活化致癌物等方式〔6〕。結(jié)直腸癌患者腸道菌群水平與健康人群存在差異，這與文獻(xiàn)研究一致〔7〕。雙歧桿菌、乳酸桿菌等腸道有益菌能夠與腸道黏膜結(jié)合形成生物學(xué)屏障，保護(hù)腸道不受生物、化學(xué)因素的侵襲，達(dá)到防癌作用。腸球菌、腸桿菌等在正常情況下通過(guò)釋放毒素相互制約，并能達(dá)到一種平衡狀態(tài)，當(dāng)菌群失調(diào)時(shí)，可破壞腸道的微生態(tài)，使腸道黏膜的屏障功能減弱，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生；糞腸球菌可在腸道產(chǎn)生大量自由基、過(guò)氧化物等有害物質(zhì)損傷腸道DNA，引起腫瘤發(fā)生。目前對(duì)于膳食纖維抗癌及機(jī)制的研究較多且復(fù)雜〔8～11〕，本研究發(fā)現(xiàn)，膳食纖維對(duì)腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。綜合腸道菌群與結(jié)直腸癌的關(guān)系，提示膳食纖維可能通過(guò)提高腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的水平，降低腸道中大腸桿菌、腸球菌等有害菌的水平，影響腸道菌群在結(jié)腸癌發(fā)病過(guò)程中的作用。但本研究并未將膳食纖維攝入情況與腸道菌群構(gòu)成及結(jié)直腸癌的進(jìn)展進(jìn)一步研究。因此，今后研究應(yīng)加大樣本量，進(jìn)一步探索纖維攝入情況與腸道菌群構(gòu)成及結(jié)直腸癌進(jìn)展的關(guān)系。

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〔2017- 04- 21修回〕

(編輯 袁左鳴)

張 濤(1974- )，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸外科方面的研究 。

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A

1005- 9202(2017)15- 3853- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.096