蔡 柳，蘇小軍，李清明，2，熊興耀，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128； 3.中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所，北京100081）

基于均勻設(shè)計(jì)與支持向量回歸的木薯生料發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇工藝參數(shù)優(yōu)化

蔡 柳1，蘇小軍1，李清明1，2，熊興耀1，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128； 3.中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所，北京100081）

以木薯（Manihot esculenta Crantz）為試材，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合均勻設(shè)計(jì)(Uniform Design，UD)與支持向量回歸(Support Vector Regression，SVR)即UD-SVR法對(duì)生料發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。原料轉(zhuǎn)化率的最佳工藝參數(shù)為：料水比1∶3.1，初始pH4，溫度36℃，酵母添加量5.5×107cell/mL，(NH4)2SO41 g，轉(zhuǎn)速160 r/min,糖化酶添加量110 U/g,淀粉酶添加量10 U/g，纖維素酶添加量25 U/g,發(fā)酵周期120 h，原料轉(zhuǎn)化率達(dá)到38.63%。

木薯； 生料發(fā)酵； 燃料乙醇； 均勻設(shè)計(jì)； 支持向量回歸

隨著世界經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和能源消耗總量的不斷增加，能源短缺及環(huán)境污染問題將變的越來越嚴(yán)重。因此，尋求能源替代，已經(jīng)成為整個(gè)世界無可避免的選擇。近年來，以生物質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究越來越受到各國的重視[1-2]。從世界范圍來看，燃料乙醇生產(chǎn)原料主要為淀粉類、糖類、纖維質(zhì)和其他原料。其中60%為甘蔗或甜菜原料，33%為玉米[3]。國內(nèi)主要以玉米、小麥等陳化糧為生產(chǎn)原料。然而由于玉米乙醇、生物柴油以糧食、油料種子為原料，需占用大量耕地，與國家糧食安全存在矛盾，因此中國燃料乙醇生產(chǎn)要遵循“不與人爭糧”的原則，就需要突破以玉米、小麥等陳化糧為成產(chǎn)原料的瓶頸[4]。木薯作為非糧食農(nóng)產(chǎn)品，生物產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐瘠、耐水，是目前重要的淀粉和生物質(zhì)能源的原料[5]。近年來，中國已逐步開展對(duì)以木薯為原料的燃料乙醇工藝的研究和開發(fā)，相信利用木薯生產(chǎn)燃料乙醇對(duì)解決未來我國能源問題、實(shí)現(xiàn)節(jié)糧代糧和環(huán)保有著巨大的潛力和廣闊的前景。

我國對(duì)于利用木薯生產(chǎn)燃料乙醇已有報(bào)道，劉振等[6]對(duì)木薯干原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇進(jìn)行了研究，其乙醇得率為11.30%；朱德明等[7]以木薯為原料利用傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了酒精發(fā)酵的研究，優(yōu)化后得到的最終酒精體積分?jǐn)?shù)為10.22%。以上的這些研究，采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)燃料乙醇必須先通過高溫高壓蒸煮工序，存在能耗高、生產(chǎn)成本高、操作工序復(fù)雜等問題，因此生料濃醪發(fā)酵技術(shù)逐漸成為近年來國內(nèi)外爭相研究的熱點(diǎn)[8-9]。但目前國內(nèi)以木薯為原料，生料同步糖化發(fā)酵工藝的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)探討了同步糖化模式下，以木薯為原料生料發(fā)酵轉(zhuǎn)化燃料乙醇的工藝條件，為工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

以往對(duì)發(fā)酵工程配方的優(yōu)化常采用正交設(shè)計(jì)與均勻設(shè)計(jì)(Uniform Design,UD)，但配方優(yōu)化是典型的小樣本，基于經(jīng)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)最小的傳統(tǒng)方法在小樣本條件下泛化能力不足，優(yōu)化效果往往并不理想。支持向量機(jī)（Support Vector Machine，SVM）是機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域的集大成者，其結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小，較好地解決了小樣本、非線性、過擬合、維數(shù)災(zāi)和局極小等問題，泛化推廣能力優(yōu)異[10-12]。均勻設(shè)計(jì)用于快速搜索支持向量機(jī)最優(yōu)參數(shù)已有研究，但均勻設(shè)計(jì)與支持向量回歸（Support Vector Regression，SVR）結(jié)合用于配方優(yōu)化設(shè)計(jì)很少報(bào)道。

此方法拋開正交設(shè)計(jì)整齊可比的要求，只考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的均勻分散性，可使每因素每水平僅做一次實(shí)驗(yàn)，因而實(shí)驗(yàn)次數(shù)可大幅度降低[13]。且具有預(yù)測(cè)精度高、指導(dǎo)性強(qiáng)、可解釋性好、優(yōu)化高效的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用生料同步糖化發(fā)酵工藝生產(chǎn)乙醇，以均勻設(shè)計(jì)結(jié)合支持向量回歸的配方優(yōu)化新方法——UD-SVR，對(duì)工藝配方進(jìn)行了優(yōu)化，取得了顯著的成效。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯：湖南龍山縣金山實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司提供；其粉碎后的木薯粉檢測(cè)得淀粉含量68.8%。

糖化酶：由曲霉優(yōu)良菌種（Aspergilusniger）經(jīng)深層發(fā)酵提煉而成,本實(shí)驗(yàn)所用糖化酶購自無錫杰能科生物工程有限公司，實(shí)際酶活為8000 U/mL。

α-淀粉酶，纖維素酶：無錫杰能科生物工程有限公司購買，實(shí)際酶活均為2000 U/mL。

酵母：采用安琪耐高溫釀酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母活化

稱取一定量的活性干酵母，加入5～10倍的水，2%的葡萄糖，在40℃條件下水浴30 min，即可作為酒母使用。

1.2.2 工藝流程

將木薯切片、曬干，粉碎，過40目篩備用。稱取一定量木薯粉和水于500 mL發(fā)酵瓶中混合，加入復(fù)合酶系（糖化酶、淀粉酶、纖維素酶），硫酸銨，然后添加經(jīng)活化后的酵母，充分混勻，調(diào)節(jié)初始pH值，放入恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，取出蒸餾，測(cè)定。

1.2.3 乙醇得率測(cè)定

等比例取100 mL發(fā)酵好的醪液和100 mL水于500 mL蒸餾瓶中，蒸餾并收集蒸餾液100 mL，比重法測(cè)量此溶液的乙醇濃度及溫度，查表校正后得到發(fā)酵醪乙醇得率。

1.2.4 原料轉(zhuǎn)化率測(cè)定

1.3 支持向量機(jī)LIBSVM 2.8軟件包

LIBSVM 2.8軟件包簡單易用，含4個(gè)常用程序：Svmscale用于對(duì)原始數(shù)據(jù)規(guī)格化，Svmtrain用于訓(xùn)練，Svmpredict用于預(yù)測(cè)，Gridregression.py用于自動(dòng)搜索核函數(shù)最優(yōu)參數(shù)c,g,p(c∈[-1,10]，g∈[-8,1]，p∈[-8,0]，步長均為1)。各程序用法及其參數(shù)設(shè)置參見文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基準(zhǔn)配方及各因素上下限

整個(gè)工藝配方考慮10因素，在前期工作基礎(chǔ)上，參考馬鈴薯配方[15]，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)初步優(yōu)化后得到優(yōu)化配方，并以其為基準(zhǔn)設(shè)置各因子上下限，見表1。

2.2 第1輪均勻設(shè)計(jì)及結(jié)果

按10個(gè)因子30個(gè)處理采用DPS進(jìn)行混合水平均勻設(shè)計(jì)，各處理因子組合及其乙醇得率Y1（v/v）、原料轉(zhuǎn)化率Y2（100%）見表2，其中處理N4因各參數(shù)設(shè)計(jì)問題，醪液過濃導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，不參與后續(xù)分析。

N1—N30為均勻設(shè)計(jì)處理，Y1為乙醇得率，Y2為原料轉(zhuǎn)化率。

從表2可以看出：在30個(gè)處理中，除N4因工藝參數(shù)設(shè)置問題沒有結(jié)果外，其余29個(gè)工藝條件發(fā)酵培養(yǎng)得到的乙醇濃度共有9個(gè)處理都超過了基準(zhǔn)預(yù)測(cè)值，并且最高達(dá)到了15.7%，此時(shí)的原料轉(zhuǎn)化率為32.83%。比較這9個(gè)處理的乙醇得率和原料轉(zhuǎn)化率，處理N19的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了33.91%，此時(shí)的乙醇得率為12.6%。為使原料轉(zhuǎn)化率都達(dá)到較高的水平，在第一輪實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將作進(jìn)一步的分析。

表1 基準(zhǔn)方案、水平數(shù)和各因素預(yù)測(cè)上下限

表2 第1輪均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

表3 基于轉(zhuǎn)化率的篩選過程

2.3 基于SVR非線性變量篩選

由于各個(gè)因子與乙醇得率及原料轉(zhuǎn)化率之間往往呈非線性關(guān)系，采用傳統(tǒng)的逐步線性回歸等線性自變量篩選方法無法滿足要求，袁哲明等[16]、譚顯勝等[17]基于SVR給出了一種非線性的變量篩選方法：以多輪末尾淘汰法從包含全部輸入變量的SVR模型中以留一法依MSE最小原則非線性逐次剔除對(duì)提高預(yù)測(cè)精度不利的變量，直到?jīng)]有因子被剔除為止，經(jīng)篩選后的變量即為保留因子。該方法可給出各因子相對(duì)重要性順序，使模型具備一定解釋能力。

因在實(shí)際應(yīng)用中，往往要求配方轉(zhuǎn)化率高，因此下面分別以乙醇得率和原料轉(zhuǎn)化率為目標(biāo)值進(jìn)行分析。對(duì)各個(gè)因子采用留一法篩選的過程及結(jié)果見表3。由表3可知，基于原料轉(zhuǎn)化率的最優(yōu)保留因子為 X1、X2、X3、X5、X6和 X7。因子篩選前后的留一法預(yù)測(cè)性能對(duì)比結(jié)果見表4。由表4可知，經(jīng)過因子篩選后的模型性能均有不同程度的提高。

2.4 模型顯著性檢驗(yàn)、單因子重要性分析及效應(yīng)分析

模型顯著性檢驗(yàn)：以往常通過與參比模型比較均方誤差（Mean Squared Error，MSE）來評(píng)估SVR所建模型優(yōu)劣，但不同數(shù)據(jù)集間不具可比性，且模型是否可用不能給出定性判斷。為檢驗(yàn)SVR模型回歸是否顯著，可采用統(tǒng)計(jì)量：F=U/m'/(Q/(n-m'-1))進(jìn) 行 檢 驗(yàn) ，其 自 由 度 為 (m'，n-m'-1)，其 中 U=為回歸平方和，它反映由因子的變化所引起的y的波動(dòng)，Q反映實(shí)驗(yàn)誤差與其他原因引起的誤差和，y?i為第i個(gè)樣本回代Model-SVR的擬合值，yi為第 i個(gè)樣本的實(shí)測(cè)值，yˉi為 yi的平均值。若F＞Fa(m'，n-m'-1)，則表明在a水平上SVR模型非線性回歸顯著。

表4 篩選因子前后的留一法對(duì)比

單因子重要性分析：如因子xj對(duì)因變量y有重要影響，則預(yù)測(cè)值y?將隨xj的變化而明顯變化。將因子xj固定為xˉj（可視為xj的零水平），代入Model-SVR，由預(yù)測(cè)值可得到回歸平方和Uj、剩余平方和Qj。則U-Uj代表了因子xj對(duì)增加回歸平方和的貢獻(xiàn)，則可用統(tǒng)計(jì)量對(duì)因子xj的重要性進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，其自由度為(1，n-m'-1)[18]。

單因子效應(yīng)：單因子xj的變動(dòng)對(duì)y的影響趨勢(shì)，反應(yīng)xj的最優(yōu)取值范圍。分析xj的單因子效應(yīng)，可將除xj外的各因子均固定為其均值，令xj在給定取值區(qū)間內(nèi)按一定步長取值，并代入Model-SVR得預(yù)測(cè)值，作出 xj-圖。當(dāng)其他因子取其均值時(shí)，可知因變量隨xj的變化規(guī)律，特別是因變量取極值時(shí)xj的值。

表5表明：單從原料轉(zhuǎn)化率分析，各個(gè)因子對(duì)其影響大小排序：X2＞X1＞X5＞X3＞X6＞X7，并根據(jù)單因子靈敏度分析結(jié)果顯示：X1：30，X2：36，X3：5.5，X5：120，X6：1，X7：200，均為邊界，基于X1、X2、X3、X5、X6、X7，依次加入被篩選掉的因子，并分別預(yù)測(cè)其最優(yōu)值，得到：X4：160；X8：10；X9：25；X10：3。

2.5 第2輪均勻設(shè)計(jì)及結(jié)果

經(jīng)第1輪均勻設(shè)計(jì)及分析，10個(gè)因子中7個(gè)已基本固定，其余非保留變量根據(jù)調(diào)整的上下限，從表2第1輪均勻設(shè)計(jì)結(jié)果出發(fā)，基于單因子效應(yīng)分析進(jìn)行第2輪實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化。第2輪均勻設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6，從原料轉(zhuǎn)化率看，整體的轉(zhuǎn)化率明顯高于第1輪設(shè)計(jì)。

3 結(jié)論與討論

3.1 采用均勻設(shè)計(jì)與支持向量回歸相結(jié)合的方法對(duì)木薯發(fā)酵產(chǎn)乙醇工藝進(jìn)行優(yōu)化，此方法是袁哲明等[19]提出的一種新的配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方法。對(duì)一個(gè)10因子混合水平的復(fù)雜工藝參數(shù)優(yōu)化問題，UD-SVR僅通過兩輪的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，其乙醇得率和原料轉(zhuǎn)化率均有了明顯的提高，得到分別以乙醇得率和原料轉(zhuǎn)化率為重的兩種工藝條件。綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)中各方面的因素，并結(jié)合均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2，木薯生料發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇最佳工藝參數(shù)為：料水比1∶1.8，溫度32℃，酵母添加量3.5×107cell/mL，轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵時(shí)間為120 h，硫酸銨添加量0.5 g，糖化酶添加量200 U/g,淀粉酶添加量12 U/g，纖維素酶添加量25 U/g,初始pH3.5，此時(shí)的乙醇得率達(dá)到15.7%，原料轉(zhuǎn)化率為32.83%。

3.2 木薯生料同步糖化發(fā)酵使糖化和發(fā)酵在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，同傳統(tǒng)工藝中的高溫蒸煮工序相比，能大幅度節(jié)省能量及設(shè)備投資；除此之外木薯淀粉糖化時(shí)產(chǎn)生的葡萄糖能立即被酵母利用，有利于防止雜菌的污染，保證發(fā)酵充分。李志平等[20]對(duì)生木薯淀粉直接進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，酒精度較低，僅為7.04%。通過UD-SVR法優(yōu)化發(fā)酵工藝，其最高的醪液乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了15.7%，相比傳統(tǒng)的生產(chǎn)大大提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，同時(shí)簡化了工序操作、節(jié)約能耗。

表5 模型顯著性及單因子重要性分析(原料轉(zhuǎn)化率)

表6 第2輪均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

3.3 木薯經(jīng)過加工發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中，產(chǎn)生了大量的木薯渣、稈殘余，因而對(duì)木薯渣、稈的綜合利用凸顯重要。國內(nèi)外對(duì)木薯渣的綜合利用研究，主要集中在生產(chǎn)飼料，活性炭、單細(xì)胞蛋白、草酸、栽培食用菌及還田等方面。用木薯渣做飼料可以變廢為寶，使資源得到最大限度的利用，也為今后的研究提供了方向。

[1] 蘇小軍,熊興耀,譚興和,等.燃料乙醇發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,33(4)：480-485.

[2]OMENU A M,AKPAN I,BANKOLE M O,et al.Hydrolysis of raw tuber starches by amylase of Aspergillus niger AM07 isolated from the soil[J].African journal of biotechnology,2005,4(1)：19-25.

[3]HIMAN N D,SCHELL D J,RILEY J,et al.Preliminary estimate of the cost of ethanol production for stimultaneous saccharification and fermentation technology[J].Appl biochem biotechnol,1992,34：639-649.

[4] 宋安東,裴廣慶,王風(fēng)芹,等.中國燃料乙醇生產(chǎn)用原料的多元化探索[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(3)：303-306.

[5] 董丹丹,趙黛青,廖翠萍,等.木薯燃料乙醇生產(chǎn)的技術(shù)提升及全生命周期能耗分析[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(7)：160-164.

[6] 劉振,王金鵬,張立峰,等.木薯干原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[J].過程工程學(xué)報(bào),2005,5(3)：353-355.

[7] 朱德明,匡鈺,韓志萍,等.木薯酒精發(fā)酵工藝研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,39(4)：470-473.

[7] 譚顯勝,王志明,譚泗橋,等.支持向量回歸可解釋性體系的建立[J].系統(tǒng)仿真學(xué)報(bào),2009(12)：7795-7797.

[8]ABU E A,ADO S A,JAMES D B.Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace[J].African journal of biotechnology,2005,4(8)：785-790.

[9] 張欣,呂偉民.生料發(fā)酵生產(chǎn)酒精技術(shù)探討[J].釀酒,2009,36(2)：84-85.

[10] 方開泰.均勻設(shè)計(jì)-數(shù)論方法在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的應(yīng)用[J].應(yīng)用數(shù)學(xué)學(xué)報(bào),1980,3(4)：363-372.

[11] MA G L,CHENG YY.Predicting Caco-2 permeability using support vector machine and chemistry development kit[J].Journal of pharmacy and pharmaceutical sciences,2006,9(2)：210-221.

[12]GUPTA S,MANOHAR C S.An improved response surface method for the determination of failure probability and importance measures[J].Structural safety,2004,26：123-139.

[13] 唐啟義,馮明光.實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京：科學(xué)出版社,2002：147-170.

[14] CHANG C C,LIN C J.LIBSVM:a library for support vector machines[J].ACM transactions on intelligent systems and technology,2011,2(3)：27.

[15] 蘇小軍.馬鈴薯生料發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2009：80-82.

[16] 袁哲明,熊潔儀,張永生.基于SVR和K-近鄰群的組合預(yù)測(cè)在QSAR中的應(yīng)用[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(3)：163-169.

[17] 譚顯勝,袁哲明,周鐵軍,等.Multi-KNN-SVR組合預(yù)測(cè)在含氟化合物QSAR研究中的應(yīng)用[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2008,29(1)：95-99.

[18] 裴鑫德.多元統(tǒng)計(jì)分析及其應(yīng)用[M].北京：農(nóng)業(yè)大學(xué)出版業(yè)社,1991：465-473.

[19] 袁哲明,左斌,譚泗橋,等.基于均勻設(shè)計(jì)與支持向量回歸的發(fā)酵配方優(yōu)化[J].過程工程學(xué)報(bào),2009,9(1)：148-152.

[20] 李志平,龐宗文.生木薯淀粉直接發(fā)酵生產(chǎn)酒精的發(fā)酵條件研究[J].釀酒科技,2005(12)：57-59.

Optimization of Technical Parameters of Ethanol Fermentation by Uncooked Cassava Based on Uniform Design and Support Vector Regression

CAI Liu1,SU Xiaojun1,LI Qingming1,2and XIONG Xingyao1,3
(1.Hunan Provincial Key Lab of Crop Germplasm Innovation and Utilization,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128;2.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128;3.Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

On the basis of single factor test coupled with uniform design and support vector regression,the technical parameters in ethanol production by the fermentation of Manihot esculenta Crantz were optimized as follows:solid-liquid ratio was 1∶3.1,initial pH=4,fermenting temperature was at 36℃,yeast inoculating amount was 5.5×107cell/mL,(NH4)2SO4=1 g,rotating speed=160 r/min,the adding level of glucoamylase,a-amylase and cellulose were 110 U/g,10 U/g and 25 U/g respectively,and the fermentation cycle was 120 h.As a result,the transmission rate of raw material could reach up to 38.63%.

cassava;fermentation of uncooked material;fuel ethanol;uniform design;support vector regression

TS262.2；TS261.4；TS261.2

A

1001-9286（2017）07-0052-06

10.13746/j.njkj2017044

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-12）。

2017-03-01

蔡柳（1982-），女，白族，助理研究員，從事生物質(zhì)能源方面的研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-05-03；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170503.1021.001.html。