謝建軍，吳俊輝，曾廣豐，丁 博，王志元，盧 麗，陳文銳

(1.廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州510623； 2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實驗室，廣東廣州510623)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中11種磺酰脲類除草劑殘留量

謝建軍1，2，吳俊輝1，2，曾廣豐1，2，丁 博1，2，王志元1，2，盧 麗1，2，陳文銳1，2

(1.廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州510623； 2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實驗室，廣東廣州510623)

建立了固相分散萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS-MS)快速測定葡萄酒中11種磺酰脲類除草劑殘留量的方法。樣品用乙腈快速提取、氯化鈉和無水硫酸鎂鹽析后，經(jīng)C18粉、中性Al2O3粉組合吸附劑凈化，LC/MS-MS外標(biāo)法定性定量。11種除草劑在10～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.9921～0.9998范圍內(nèi)?？瞻讟悠诽砑訕?biāo)準(zhǔn)品濃度在10～50 μg/kg時，其回收率在66.7%～86.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)小于8.5%，方法的檢出限(LOD)介于1.5～6.8 μg/kg之間。本方法簡單、準(zhǔn)確、快速，適用于葡萄酒中11種磺酰脲類除草劑殘留量的檢測。

QuEChERS； 葡萄酒； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 除草劑

目前，我國葡萄酒消費(fèi)量已達(dá)到每年12億升，巨大的市場需求帶動葡萄酒進(jìn)口量不斷攀升。與此同時，葡萄酒的質(zhì)量安全和品質(zhì)也越來越受到人們的重視[1]。葡萄在種植生長過程中因易受到病蟲、草害的侵?jǐn)_而被施用殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等多種農(nóng)藥。在釀制葡萄酒的過程中，部分殘留農(nóng)藥會進(jìn)入葡萄酒中，造成農(nóng)藥殘留[2]。農(nóng)藥殘留對葡萄酒的發(fā)酵具有一定影響，并給葡萄酒的感官質(zhì)量帶來不良影響，同時，葡萄酒中殘留的農(nóng)藥也會對消費(fèi)者帶來食品安全隱患[3]。目前，檢測葡萄酒農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[7-9]，但葡萄酒中磺酰脲類除草劑殘留量的檢測方法鮮有報道。

我國在葡萄酒及釀酒葡萄農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)方面與發(fā)達(dá)國家相比還有不小的差距。歐盟制定了釀酒葡萄的最大農(nóng)藥殘留限量（MRLs），但并未專門制定葡萄酒中農(nóng)藥MRLs[10]，意大利、瑞士、加拿大、澳大利亞制定了葡萄酒中部分殺菌劑和殺蟲劑MRLs[11-12]。我國由于葡萄酒法規(guī)不完善，目前并沒有單獨(dú)制定葡萄酒中農(nóng)藥的MRLs，還是參照GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中葡萄的農(nóng)藥殘留限量指標(biāo)[13]。

本研究在QuEChERS前處理的基礎(chǔ)上，通過對5種凈化吸附劑篩選，確定C18粉30.0 mg和Al2O3粉30.0 mg吸附劑組合，優(yōu)化了LC/MS-MS質(zhì)譜參數(shù)和液相條件，確定液相色譜柱，建立了同時檢測葡萄酒中11種磺酰脲類除草劑殘留量的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑及儀器

葡萄酒樣品：由廣東出入境檢驗檢疫局轄區(qū)口岸提供。

試劑及耗材：乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、甲酸(色譜純，CNW Technologies公司)；實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的超純水（電阻率為18.2 MΩ）；Atlantis?T3色譜柱(3.0 mm×100 mm，3μm，美國Waters公司)；Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；PSA(乙二胺-N-丙基硅烷，粒度 40～63 μm，CNW Technologies公司)；石墨化碳黑(GCB，粒度120～400目)、中性氧化鋁粉(Al2O3，粒度100～200目)、氨丙基粉(NH2，粒度 200～400 目)，C18粉(C18，粒度100～200目，北京振翔工貿(mào)有限公司)；芐嘧磺隆,甲黃隆、氟磺隆等11種除草劑混標(biāo)購自德國Dr．Ehrenstorfer公司，50 μg/mL。

儀器設(shè)備：API4000Q Trap超高壓液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)；IKA Ms 3 basic渦旋振蕩器(德國IKA公司)；Heidolph promax 2020水平振蕩儀(德國Heidolph公司)；Sigma 3-18 K，1-14離心機(jī)(美國Sigma公司)；Milli-Q超純水裝置(美國Millipore公司)；0.22 μm微孔濾膜(美國Whatman公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確量取50 μg/mL 11種除草劑農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃冰箱中保存。使用前根據(jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白基質(zhì)提取液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1 提取

稱取10 g（精確至0.01 g）葡萄酒于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈提取溶劑，渦旋振蕩1 min后加入1 g氯化鈉、4 g無水硫酸鎂、0.5 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，混勻后置于水平振蕩器中振蕩10 min，4500 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.2 凈化

取1.3.1中上清液1 mL于1.5 mL離心管中，加入30 mg C18、30 mg Al2O3粉，渦旋1 min，12000 r/min高速離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，LC/MSMS上機(jī)測定。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7μm）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：35℃；流動相：A-甲醇；B-0.1%甲酸-5mmol/L甲酸銨；梯度洗脫條件見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧式離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描，MRM模式，質(zhì)譜參數(shù)：氣簾氣（CUR）N2，20 psi；電離電壓（IS），5500 V；離子源溫度（TEM），550 ℃；霧化氣（GAS1）N2，50 psi；加熱輔助氣（GAS2）N2，50 psi；碰撞氣（CAD）N2，MEDIUM；監(jiān)測方式MRM。

表1 ESI模式下液相色譜洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件優(yōu)化

本實驗以11種除草劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ng/mL）進(jìn)樣，分別比較了乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液、甲醇-0.1%（V/V）甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液，甲醇-0.2%（V/V）乙酸水溶液、甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L甲酸銨溶液等5種流動相對于各種除草劑的色譜分離及質(zhì)譜響應(yīng)的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，使用乙腈作為有機(jī)相，個別除草劑沒有質(zhì)譜響應(yīng)，使用甲醇作為有機(jī)相，11種除草劑均有良好的質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇甲醇作為有機(jī)相，0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液作為水相，可使11種除草劑有良好的色譜分離及質(zhì)譜響應(yīng)。

磺酰脲類化合物由芳環(huán)、磺酰脲橋和雜環(huán)三部分組成，在正離子電噴霧電離模式下，易形成較高豐度的[M+H]+準(zhǔn)分子離子。三氟啶磺隆鈉、甲基碘磺隆鈉為鈉鹽，在正離子模式下形成[M-Na+H]+準(zhǔn)分子離子?；酋ｋ孱惓輨┑馁|(zhì)譜斷裂主要發(fā)生在磺酰脲橋上，易產(chǎn)生m/z 141、m/z 167、m/z 156、m/z 182等碎片離子，以醚苯磺隆1為例，磺酰脲類除草劑碎裂方式見圖1，11種除草劑的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 吸附劑的選擇優(yōu)化

2.2.1 吸附劑種類和用量的篩選

圖1 醚苯磺隆的二級質(zhì)譜圖主要質(zhì)譜裂解產(chǎn)物

本實驗采用回收試驗法，篩選合適的吸附劑的組成和比例，以期獲得滿足農(nóng)藥殘留量分析的凈化效果。分別稱取30 mg、50 mg、100 mg、150 mg的PSA粉、GCB粉、NH2粉、Al2O3粉和C18粉于1.5 mL離心管中，加入50 μg/L的11種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋1 min，靜置10 min，12000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，經(jīng)LC/MS-MS分析。結(jié)果表明，PSA粉、NH2粉和GCB粉對磺酰脲類除草劑吸附較明顯，回收率介于0%～47.4%之間，與文獻(xiàn)[14]報道的0%～38%接近，NH2粉同樣有較明顯的吸附，回收率＜40%；C18粉和Al2O3粉對于11種除草劑的吸附作用不明顯，回收率在60%以上,所以本實驗考慮選用C18粉和Al2O3粉作為凈化吸附劑的種類。

2.2.2 吸附劑最佳組合的確定

通過2.2.1的初步實驗，確定了吸附劑的種類和大致用量范圍，為進(jìn)一步優(yōu)化吸附劑的用量，設(shè)計實驗考察4組C18粉、Al2O3粉的組合回收實驗。將C18粉20 mg、30 mg與Al2O3粉20 mg、30 mg進(jìn)行組合，具體操作按照2.2.1進(jìn)行。實驗結(jié)果表明，C18粉30 mg、Al2O3粉30 mg組合的回收率良好，可滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。因此確定30 mg C18粉、30 mg Al2O3粉的組合作為吸附劑，后續(xù)的實驗也表明上述組合完全可以滿足葡萄酒中這11種除草劑殘留檢測的要求。

2.3 提取溶劑的選擇

通過對空白葡萄酒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，本實驗比較了乙腈、1%醋酸乙腈對葡萄酒中11種除草劑的提取效率。實驗結(jié)果表明，乙腈和1%醋酸乙腈作為提取溶劑均能獲得較滿意的回收率，但是大部分除草劑用純乙腈作提取溶劑的回收率高于1%醋酸乙腈的回收率。因此，本實驗選擇乙腈作為葡萄酒中11種除草劑殘留量檢測的提取溶劑，兩種提取溶劑回收率結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取溶劑對空白葡萄酒添加11種除草劑回收率的影響

2.4 線性范圍與檢測限

采用空白葡萄酒樣品，按“1.3樣品預(yù)處理”凈化后的基質(zhì)溶液配制濃度分別為10μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4色譜與質(zhì)譜條件”測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到其相關(guān)線性方程。結(jié)果表明，11種農(nóng)藥在10～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.9921～0.9998之間,根據(jù)信噪比S/N≥3確定方法的檢測限(LOD)在1.5～6.8 μg/kg之間，11種除草劑的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)、檢出限、線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2和表3。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的去除

由于葡萄酒樣品基質(zhì)復(fù)雜，比較純乙腈和空白葡萄酒基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量時，發(fā)現(xiàn)純乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線在定量情況下除草劑的響應(yīng)受到不同程度的基質(zhì)效應(yīng)影響。基質(zhì)效應(yīng)(ME)計算公式為：ME(%)=(A1-A2)/A2×100%，其中A1、A2分別為基質(zhì)與空白溶液中除草劑的響應(yīng)值。由計算結(jié)果可知，胺苯磺隆表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME(%)為-84.18%，甲磺胺磺隆基質(zhì)效應(yīng)ME(%)分別為9.9%，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，另外9種除草劑則表現(xiàn)為較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME(%)在14.4%～111.3%之間，結(jié)果見表3。因此，本方法使用空白葡萄酒樣品凈化后基體配制標(biāo)準(zhǔn)，制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

表2 11種除草劑的質(zhì)譜參數(shù)、線性方程和相關(guān)系數(shù)

表3 空白葡萄酒樣品中添加11種除草劑標(biāo)準(zhǔn)的測定保留時間、檢測限、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 方法的精密度、準(zhǔn)確度

按“1.3樣品預(yù)處理”步驟，測定方法的回收率和精密度。在葡萄酒空白樣品中分別添加10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg 3個水平的11種除草劑標(biāo)準(zhǔn)，每個添加水平平行實驗6次，計算11種除草劑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值（%）。結(jié)果表明，11種除草劑的平均回收率處于66.7%～86.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)＜8.5%，結(jié)果見表3?？瞻灼咸丫苹w配制11種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖見圖3。

2.7 實際樣品測定

采用本研究建立的QuEChERS前處理方法結(jié)合LC-MS/MS分析方法對法國、西班牙、澳大利亞、意大利等不同國家的40個葡萄酒樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11種除草劑均沒有檢出。

3 結(jié)論

圖3 11種除草劑的多反應(yīng)檢測色譜圖

本實驗主要應(yīng)用QuEChERS法對葡萄酒中11種除草劑殘留進(jìn)行前處理，研究優(yōu)化了提取溶劑和凈化用吸附劑種類及用量，優(yōu)化了LC/MS-MS質(zhì)譜參數(shù)和液相條件，建立了固相分散萃取凈化，LC/MS-MS同時檢測葡萄酒中11種除草劑殘留量快速檢測方法。樣品經(jīng)乙腈振蕩提取，C18粉30.0 mg和Al2O3粉30.0 mg，吸附雜質(zhì)凈化后，用LC/MSMS外標(biāo)法定性定量。結(jié)果表明，當(dāng)添加水平為10～50 μg/kg時，11種除草劑的回收率介于66.7%～86.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)小于8.5%，方法的檢出限(LOD)介于1.5～6.8 μg/kg之間。本方法可同時一次性檢測11種除草劑，前處理簡單，操作簡便，方法的重現(xiàn)性好，靈敏度高，可用于我國進(jìn)口葡萄酒質(zhì)量監(jiān)管及國內(nèi)市場葡萄酒質(zhì)量監(jiān)測。

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Determination of 11 Kinds of Sulfonylurea Herbicide Residues in Grape Wine by QuEChERS Combined with LC/MS-MS

XIE Jianjun1,2,WU Junhui1,2,ZENG Guangfeng1,2,DING Bo1,2,WANG Zhiyuan1,2,LU Li1,2and CHEN Wenrui1,2
(1.Technical Center of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou,Guangdong 510623;2.Guangdong Technical Measures Research Key Lab of Import and Export Animal,Plant and Food,Guangzhou,Guangdong 510623,China)

The method for rapid determination 11 kinds of sulfonylurea herbicide residues in grape wine by solid-phase dispersion combined with LC/MS-MS had been developed in this study.11 kinds of herbicide residues were extracted from wine samples with acetonitrile,salted out with sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate,and cleaned up with C18and Al2O3powder.These residues were detected by LC/MS-MS with external standard method.The results showed that,there was a good linear relationship in range of 10～100 μg/L,the correlation coefficients were in the range of 0.9921～0.9998,the recoveries were in the range of 66.7%to 86.1%at the spiked levels of 10～50 μg/kg in grape wine,RSDs was less than 8.5%(n=6),and the limit of detection were 0.2～10 μg/kg.This newly-developed method had the advantages including simple operation and accurate and rapid determination,and it could be used for the determination of 11 kinds of sulfonylurea herbicide residues in grape wine.

QuEChERS;grape wine;LC/MS-MS;herbicides

TS262.6；TS261.7；O657.63；S482.4

A

1001-9286（2017）07-0115-06

10.13746/j.njkj.2017052

廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2014GDK13）。

2017-03-08

謝建軍（1972-），男，高級工程師，博士，主要研究方向為食品安全檢測技術(shù)。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-05-25；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170525.1314.005.html。