羅瓊++衛(wèi)興國++曹瑩++劉佳

摘 要：目的：研究胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞的IGF2BP2基因表達(dá)的情況。方法：以不同濃度胰島素刺激產(chǎn)生有胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞，提取各組細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以Real-Time PCR方法測定目的基因的表達(dá)量。結(jié)果：胰島素高、中濃度組的細(xì)胞外液葡萄糖濃度明顯高于正常組（P<0.05），胰島素抵抗現(xiàn)象最為顯著的中濃度組的IGF2BP2基因表達(dá)量顯著增加（P<0.01）。結(jié)論：胰島素抵抗明顯的HepG2細(xì)胞的IGF2BP2基因表達(dá)量同步增加，IGF2BP2表達(dá)可能與胰島素抵抗現(xiàn)象有關(guān)。

關(guān)鍵詞：IGF2BP2基因；胰島素抵抗；HepG2細(xì)胞

中圖分類號：R363 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）12-0195-02

2型糖尿病的產(chǎn)生，主要?dú)w因?yàn)橐葝u素抵抗和胰島β細(xì)胞功能紊亂。胰島素抵抗現(xiàn)象，是由于肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的胰島素受體對胰島素敏感性下降，即正常濃度的胰島素不能促進(jìn)血糖利用而導(dǎo)致。體外建立的胰島素抵抗細(xì)胞模型，是利用不同藥物直接誘導(dǎo)組織細(xì)胞，使組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，葡萄糖吸收量減少，產(chǎn)生胰島素抵抗。這種胰島素抵抗細(xì)胞模型可直觀的研究胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制，消除環(huán)境因素的影響，非常方便。胰島素抵抗產(chǎn)生的主要器官是肝臟、肌肉和脂肪組織，因此，體外建立胰島素抵抗細(xì)胞模型的常用細(xì)胞有HepG2人肝癌細(xì)胞等[1]。

IGF2BP2（胰島素樣生長因子2結(jié)合蛋白2）基因在不同型糖尿病患者中的表達(dá)具有特異性。前期在不同型糖尿病的患者和正常人中，我們對IGF2BP2基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2基因表達(dá)量水平與胰島素水平無直接聯(lián)系，但是與胰島素抵抗現(xiàn)象可能存在聯(lián)系。然而，臨床患者在進(jìn)行基因檢驗(yàn)時無法排除環(huán)境因素對2型糖尿病產(chǎn)生的影響[2]，課題組擬用可排除環(huán)境因素影響的胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞，進(jìn)一步探索IGF2BP2基因表達(dá)和胰島素抵抗現(xiàn)象的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PCR產(chǎn)物純化試劑盒、Trizol Reagent、RNase、Oligo dT（Invitrogen公司產(chǎn)品）；Power SYBR Green PCR Master Mix、Taqman Universal PCR Master Mix試劑盒（ABI公司產(chǎn)品）；Sensiscript RT試劑盒（QIAGEN公司產(chǎn)品）；其余反應(yīng)中所用試劑均為分析純。實(shí)時熒光定量PCR儀（ABI公司產(chǎn)品）。HepG2細(xì)胞株為中南大學(xué)秦志勇教授惠贈。

1.2 引物和探針設(shè)計(jì)

引物為5-CACCGGAAGCCCAGTTCAA-3和 5-CCACCTTTGCCAATCACCC-3；探針序列為5-TGAAGCTGGAAGCGCATATCAGAG-3。引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的建立

按照金水華的研究方式建立胰島素抵抗細(xì)胞模型[3]：HepG2細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)。長滿瓶底后，用PBS洗2次，胰蛋白酶消化后，按1：3比例傳代培養(yǎng)。

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L，移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%后，胰島素抵抗細(xì)胞模型各組換成含胰島素濃度為10-5、10-6、10-7mol/L的培養(yǎng)基，為胰島素高、中、低濃度組，對照組為常規(guī)培養(yǎng)基。培養(yǎng)72h后，用葡萄糖氧化酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量。計(jì)算對照組與不同胰島素濃度組細(xì)胞的葡萄糖含量消耗差值，達(dá)到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用濃度為胰島素最佳濃度。

1.4 細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成

每組吸取細(xì)胞外液測糖時，分別收獲106個細(xì)胞，按Trizol試劑說明書要求，提取總RNA，提取的RNA濃度經(jīng)紫外分光光度儀測定，確定OD260/280在1.8～2.0之間，后-80℃保存。取2μg總RNA和Sensiscript RT 試劑盒的試劑進(jìn)行反應(yīng)；將反應(yīng)體系置于37℃孵化60min，cDNA產(chǎn)物-20℃保存待用。

1.5 樣本中基因表達(dá)量的檢測

以樣本總cDNA作為模板，按照Taqman Universal PCR Master Mix試劑盒操作，在ABI Prism 7300實(shí)時熒光PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，測定樣本中目的基因的表達(dá)量。通過梯度稀釋和Real-Time PCR構(gòu)建基因定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣本中的基因表達(dá)量進(jìn)行定量。每次測定時，待測基因均與管家基因GAPDH同時進(jìn)行反應(yīng)，作為內(nèi)參。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本課題中，以IGF2BP2基因的表達(dá)量/GAPDH的表達(dá)量作為目的基因的表達(dá)量。在四組之間，兩兩采用T-test進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和分析，采用P值是否小于0.05用以判斷各組之間是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果

與正常對照組比較，胰島素高、中濃度組的細(xì)胞外液葡萄糖值顯著高于正常組（P<0.05），中等濃度10-6mol/L的胰島素刺激下，HepG2細(xì)胞外液葡萄糖濃度最高（相對正常組P<0.01），提示該組細(xì)胞對葡萄糖利用最差，胰島素抵抗最為顯著。使用實(shí)時熒光定量PCR的方法測定IGF2BP2基因在各組樣本的表達(dá)量，并使用管家基因GAPDH進(jìn)行校正，胰島素高、中濃度組的IGF2BP2基因相對表達(dá)量顯著高于對照組（P<0.01），胰島素低濃度組未見該基因表達(dá)量增高。綜合兩組數(shù)據(jù)，可以看出胰島素抵抗現(xiàn)象最為顯著的中濃度組的IGF2BP2基因表達(dá)量顯著增加，推測兩者可能具有相關(guān)性。如表1所示。

3 討論

肝臟是產(chǎn)生胰島素抵抗的主要臟器，本實(shí)驗(yàn)采用的HepG2細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞，保留肝的一般生物學(xué)特性。利用高于生理濃度的胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，部分模擬了胰島素抵抗的自然發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了，應(yīng)用10-6mol/L的胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)，可使HepG2細(xì)胞外的葡萄糖消耗降低、剩余葡萄糖增多，即發(fā)生胰島素抵抗。

本實(shí)驗(yàn)在成功建立胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型基礎(chǔ)上進(jìn)行，通過測定胰島素抵抗細(xì)胞的IGF2BP2基因相對表達(dá)量來判定胰島素抵抗程度與IGF2BP2基因表達(dá)程度的相關(guān)性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，可以看出胰島素抵抗現(xiàn)象最為顯著的中濃度組的IGF2BP2基因表達(dá)量顯著增加，推測兩者可能具有相關(guān)性。下一步實(shí)驗(yàn)，擬研究和IGF2BP2密切相關(guān)的分子，探索這一系列分子在胰島素抵抗發(fā)生中所起的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]張澤生，李雨蒙，張夢娜，等.胰島素抵抗細(xì)胞模型建立及藥物評價(jià)的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，2016，（10）：198-203.

[2]牛潔，劉銅華，楊麗霞.環(huán)境因素在2型糖尿病發(fā)生中的作用[J].2008，16（4）：440-442.

[3]金水華，吳寧，劉少芳，等.海普諾改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用研究[J].海洋科學(xué)，2015，35（3）：26-32.