高雅文，徐靜源，李鴻梅*

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

響應面試驗優(yōu)化東北黃豆醬制曲工藝

高雅文，徐靜源，李鴻梅*

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

以黃豆和面粉為主要原料，采用混合菌種制曲，以蛋白酶、淀粉酶的活性為評價指標，利用Box-Behnken響應面試驗考察不同工藝條件對豆醬曲酶活的影響。試驗結果表明，采用添加熟面粉的方式，濕豆與面粉質量比10∶4、接種量0.07%、制曲時間48 h，在此最佳制曲工藝條件下，蛋白酶酶活為1 049.83 U/g，淀粉酶酶活為781.29 U/g。

黃豆醬；制曲工藝；酶活

黃豆醬又稱大豆醬、豆醬，用黃豆熟制磨碎后接菌發(fā)酵而成，是我國傳統(tǒng)的調味醬[1-2]。豆醬有濃郁的醬香和酯香，咸甜適口，用于蘸、燜、蒸、炒、拌等各種烹調方式，也可佐餐、凈食等，是深受廣大消費者喜愛的調味食品[3-4]。

豆醬制作過程中，培養(yǎng)有益微生物進行食品發(fā)酵的過程被稱之為制曲。制曲過程中，微生物在原料上生長繁殖，分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶系[5]，為后期發(fā)酵所用。后期發(fā)酵過程中，黃豆中的酶和微生物產生的酶將蛋白質降解為多肽和多種氨基酸，淀粉降解為糊精，低聚糖和單糖，并且這些物質相互協(xié)調作用，共同影響著黃豆醬的色、香、味和體態(tài)[6-8]。因此，制曲過程，酶的活性直接影響著原料的利用率和最終產品的風味，色澤和體態(tài)。

近年來，有關單一菌種醬曲制備、醬油曲制備、蠶豆醬曲制備等研究較多，如陳玲[9]研究了制曲時間對醬曲中蛋白酶、纖維素酶、糖化酶、淀粉酶四種酶的酶活力變化的影響。烏日汗[10]研究了米曲霉培養(yǎng)時間、接種量、制曲時間、制曲溫度對粟米醬曲中蛋白酶活力及生長狀況的影響。有學者[11]對國內外三種優(yōu)良醬油生產米曲霉菌株的制曲性能進行研究，分析了中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等重要酶系的酶活變化趨勢，但混合菌種制黃豆醬曲的報道較少，并且面粉添加量對黃豆醬曲中酶活的影響研究未見報道。

米曲霉中性和堿性蛋白酶活性較強，而酸性蛋白酶活性相對較低；黑曲霉酸性蛋白酶、糖化酶、纖維酶等活性均較強，2種曲霉混合制曲可以起到酶系互補，提高原料轉化率，提升產品品質的作用[12]。本試驗采用米曲霉和黑曲霉混合菌種制曲，通過控制濕豆與面粉質量比、接種量和制曲時間，研究三者在黃豆醬制曲過程中對蛋白酶和淀粉酶活性的影響，優(yōu)化最佳工藝條件以期為工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉、黃豆：市售；米曲霉曲精（活性孢子數(shù)200×108個/g，出芽率90%）、黑曲霉曲精（活性孢子數(shù)200×108個/g，出芽率90%）：山東沂源康源生物科技有限公司；福林試劑、酪素、酪氨酸：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

JYL-F20九陽料理機：九陽股份有限公司；AL204電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；WFJ2100型可見分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；C21-RH2112多功能電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；LX-B150L立式滅菌鍋：合肥華泰醫(yī)療設備有限公司

1.3 試驗方法

1.3.1 制曲工藝流程及操作要點

操作要點：將黃豆洗凈后，加水浸泡12 h，檢出不飽滿籽粒，121℃蒸煮15 min，將生面粉放入蒸鍋，開鍋蒸煮15min，200g黃豆和定量面粉降溫至40℃以下混合于500mL燒杯中，接入定量的米曲霉曲精、黑曲霉曲精混合菌種（m米曲霉∶m黑曲霉=3∶2）[13-15]，置于培養(yǎng)箱，24 h之內曲溫控制在33～34℃，24h翻曲使醬曲溫度降至27～28℃，培養(yǎng)箱溫度調至27～28℃，24～48h控制在27～28℃，期間翻曲2～3次，得成曲。

1.3.2 單因素試驗

濕豆與面粉的質量比對豆醬曲酶活性的影響：制曲溫度24h之內33～34℃，24～48h為27～28℃，接種量為0.06%，制曲時間為48h，濕豆與面粉質量比為10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5，考察濕豆與面粉的質量比對豆醬曲酶活性的影響。

接種量對豆醬曲酶活性的影響：制曲溫度24h之內33～34℃，24～48 h為27～28℃，制曲時間為48 h，濕豆與面粉質量比為10∶4，接種量為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，考察接種量對豆醬曲酶活性的影響。

制曲時間對豆醬曲酶活性的影響：制曲溫度24 h之內33～34℃，24～52 h為27～28℃，接種量為0.06%，濕豆與面粉質量比為10∶4，制曲時間為36 h、40 h、44 h、48 h、52 h，考察制曲時間對豆醬曲酶活性的影響。

1.3.3 Box-Behnken響應面試驗優(yōu)化方案

在單因素試驗基礎上，以濕豆與面粉質量比（A）、接種量（B）、制曲時間（C）為主要因素，以蛋白酶活力（Y1），淀粉酶活力（Y2）為考核指標，進行Box-Behnken響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 測定方法

蛋白酶活性的測定：將成曲用攪拌機打碎，準確稱取5.000 g曲樣，用少量適宜的磷酸緩沖液溶解并用玻璃棒搗研，然后將上清液倒入100 mL容量瓶，沉渣中再添入少量緩沖液搗研多次，最后全部移入容量瓶，定容。采用蛋白酶活性的測定方法（GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》福林法）測定其酶活性[16]。

淀粉酶活性的測定：將成曲用攪拌機打碎，準確稱取2.000 g曲樣，轉移到50 mL容量瓶用蒸餾水定容至刻度，40℃水浴振搖30 min，于5 000 r/min離心7 min，取上清液備用。采用3,5-二硝基水楊酸法測定其酶活性[17]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗設計

2.1.1 濕豆與面粉的質量比對豆醬曲酶活性的影響

圖1 濕豆與面粉質量比對酶活性的影響Fig.1 Effect of wet beans and flour mass ratio on enzyme activity

由圖1可知，隨著面粉含量的增加，使得微生物生長所需的碳源、氮源比例趨于合理，滿足微生物大量生長繁殖的需求，所分泌出來的蛋白酶，淀粉酶大量增多，并且酶活力逐漸加大，濕豆與面粉質量比為10∶4時，蛋白酶、淀粉酶活性最強，面粉比含量繼續(xù)增加，蛋白質降解產物氨基酸和淀粉降解產物葡萄糖發(fā)生美拉德反應消耗一部分微生物生長所需的營養(yǎng)物質，使酶活下降。綜合考慮，選取濕豆與面粉質量比為10∶3、10∶4、10∶5進行響應面試驗。

2.1.2 接種量對豆醬曲酶活性的影響

圖2 接種量對酶活性的影響Fig.2 Effect of inoculum on enzyme activity

由圖2可知，接種量為0.06%時酶活性最高，添加量過少，會直接影響微生物最終的生產總量，導致酶活性低，而接種量過高，菌體數(shù)量增多，原料中氧氣和可利用的營養(yǎng)物質競爭性增加，不利于微生物生長，影響孢子的成熟，影響蛋白酶、淀粉酶的產生，導致酶活性低。綜合考慮，選取接種量0.04%、0.06%、0.08%進行響應面試驗。2.1.3制曲時間對豆醬曲酶活性的影響

圖3 制曲時間對酶活性的影響Fig.3 Effect of koji-making time on enzyme activity

經過第一次翻曲后，有白色菌絲生成，第二次翻曲后，產生大量白色菌絲，隨著時間增加，微生物活性增強，44 h時淀粉酶活性達到最高，48 h時蛋白酶活性達到最高，隨后活性降低。醬曲中米曲霉、黑曲霉利用醬曲中的營養(yǎng)物質進行自身的生長繁殖，菌體數(shù)量隨時間增加而增多，分泌的酶量越來越多，酶活逐漸增大，隨著制曲時間的延長，曲霉孢子處在生長后期，酶的活性逐漸下降。因此，選取制曲時間44 h、48 h、52 h進行響應面試驗。

2.2 回歸方程的建立與分析

2.2.1 響應面試驗結果及分析

在單因素試驗的基礎上，利用響應面法選擇最佳工藝，試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

采用Design-Expert8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型為：

蛋白酶酶活Y1＝1 015.04+24.54A+91.27B+32.01C-24.05AB-12.92AC-4.88BC-70.22A2-60.12B2-149.90C2

淀粉酶酶活Y2＝747.28+49.45A+90.63B+36.31C-14.06AB-1.34AC-17.12BC-109.50A2-70.56B2-154.99C2

表3 以蛋白酶酶活為評價指標的回歸模型方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression model using protease activity as evaluation index

表4 以淀粉酶酶活為評價指標的回歸模型方差分析結果Table 4 Variance analysis results of regression model using amylase activity as evaluation index

對模型進行回歸方程系數(shù)顯著性分析結果見表3，表4。蛋白酶活性評價模型中，一次項A、B、C，二次項AB、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），二次項AC影響顯著（P＜0.05），響應面回歸模型達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結果。淀粉酶活性模型中一次項A、B、C，二次項BC、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），二次項AB影響顯著（P＜0.05），響應面回歸模型達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結果，可用于黃豆醬制曲工藝條件對蛋白酶和淀粉酶酶活影響的研究。

2.2.2 各因素間交互作用的影響

各因素之間交互作用對醬曲中蛋白酶活性和淀粉酶活性影響的響應面如圖4所示，各試驗因素對醬曲中蛋白酶活性和淀粉酶活性的影響不是簡單的線性關系。

圖4 濕豆與面粉質量比、接種量、制曲時間交互作用對醬曲中蛋白酶活性和淀粉酶活性影響的等高線及響應面圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of wet beans and flour mass ratio,inoculum,koji-making time on protease activity and amylase activity

由Design-Expert軟件分析得到響應面值最大時對應的最佳條件是濕豆與面粉質量比10∶4.13、接種量0.073 4%、制曲時間48.32 h，蛋白酶酶活理論值為1 050.35 U/g，淀粉酶酶活理論值為780.637 U/g。為了方便實際操作，對試驗條件進行簡化，選取濕豆與面粉質量比10∶4、接種量0.07%、制曲時間48 h，三組平行試驗取平均值，蛋白酶酶活為1 049.83 U/g，淀粉酶酶活為781.29 U/g，與理論值基本相符，因此以蛋白酶酶活和淀粉酶酶活為檢測指標，響應面法優(yōu)化黃豆醬制曲工藝條件是可行的。

3 結論

本試驗重點研究了濕豆與面粉質量比、接種量、制曲時間對蛋白酶酶活和淀粉酶酶活的影響，采用Box-Behnken試驗對黃豆醬制曲工藝條件進行了優(yōu)化。得出最佳的工藝條件為：濕豆與面粉質量比10∶4、接種量0.07%、制曲時間48 h，三組平行試驗取平均值，蛋白酶酶活為1 049.83 U/g，淀粉酶酶活為781.29 U/g。

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Optimization of koji-making technology of northeast soybean paste by response surface experiments

GAO Yawen,XU Jingyuan,LI Hongmei*
(College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

Using soybean and wheat flour as main raw material,protease and amylase activity as evaluation indexes,the effect of different koji-making conditions on koji enzymatic activity of soybean paste was investigated by Box-Behnken response surface experiments.The results indicated that the protease activity and the amylase activity were 1 049.83 U/g and 781.29 U/g,respectively,with the conditions of adding cooked flour,wet beans and flour ratio 10∶4,inoculum 0.07%,and koji-making time 48 h.

fermented soybean paste;koji-making;enzyme activity

TS264.2

0254-5071（2017）06-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.019

2017-02-07

校企聯(lián)合橫向課題

高雅文（1972-），女，副教授，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：李鴻梅（1971-），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。