胡家勇，柳迪，程銀棋，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢430060）

熒光分光光度法測定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量研究

胡家勇，柳迪，程銀棋，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢430060）

建立熒光分光光度法測定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的方法。在弱酸性條件下，以鄰苯二甲醛/銨鹽為熒光指示劑，亞硫酸氫鈉為定量標準，熒光強度作為考察指標，測定樣品中的二氧化硫殘留量。結(jié)果表明，標準曲線的線性回歸方程為Y=23.22X+0.854，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8、檢出限為0.732 mg/kg、加標回收率在95.3%～104.8%之間、精密度良好、檢測結(jié)果可靠。熒光分光光度法可以作為淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的測定方法。

熒光分光光度法；比色法；二氧化硫殘留量；淀粉及其衍生物

亞硫酸鹽作為一種漂白劑、抗氧化劑和抗菌劑，廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中。亞硫酸鹽常被用作食品清潔和保存，檢測結(jié)果通常以二氧化硫殘留量計。淀粉是一種多糖，是植物貯存能量的一種方式，淀粉除食用外，也是食品行業(yè)的重要配料，工業(yè)上用于制備糊精、麥芽糖、葡萄糖、酒精等。淀粉也是百姓日常生活中必不可少的原料之一。為了保證產(chǎn)品的白度，淀粉提取工藝中會使用二氧化硫達到漂白的目的，如馬鈴薯淀粉提取時，由于馬鈴薯塊莖中含有絡(luò)氨酸酶會使淀粉變色，因此粉碎時通入二氧化硫，以抑制絡(luò)氨酸酶的作用[1]。二氧化硫?qū)θ梭w有很大傷害，長期或大劑量攝入可造成胃腸和肝臟的損壞，會使血紅蛋白減少[2-5]，因此國家規(guī)定淀粉中二氧化硫殘留量不得超過30.00 mg/kg[6]。食品中二氧化硫殘留量測定的常規(guī)方法是采用國標GB 5009.34—2016《食品安全國家標準食品中二氧化硫的測定》中的滴定法[7]及鹽酸副玫瑰苯胺比色法[8]，滴定法存在終點不敏銳，方法重復(fù)性與準確性差，并且需要蒸餾，過程比較繁瑣，不適合大量樣品的檢測；而鹽酸副玫瑰苯胺比色法所使用的吸收液四氯汞鈉存在重金屬汞污染，方法不環(huán)保；其他測定食品中二氧化硫的方法尚有高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜法[11-13]、離子色譜法等[14-16]，幾種色譜法需要相應(yīng)的設(shè)備及填充柱，檢測成本較高，對檢測人員的素質(zhì)要求也較高。

本研究是基于在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽與鄰苯二甲醛、乙酸銨反應(yīng)能夠生成異吲哚-1-磺酸鹽熒光化合物，建立了熒光光度法測定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量，以期為淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的測定提供一個方法參考，也可作為食品中二氧化硫殘留量測定的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉樣品均是市場抽檢樣品。

亞硫酸氫鈉、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（均分析純）：Aladdin科技（中國）有限公司；乙酸銨、無水乙醇（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600分子熒光分光光度計：日本日立公司；ME203/02電子天平、ME2002E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；827 pH Lab pH計：瑞士萬通有限公司；MEMMERT WNB29水浴鍋：德國Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光衍生法原理

在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽與鄰苯二甲醛、乙酸銨反應(yīng)生成異吲哚-1-磺酸鹽熒光化合物[17]，熒光強度與其濃度呈正比。以亞硫酸氫鈉作為對照品，用來定量樣品中的二氧化硫殘留量。

1.3.2 檢測波長的確定

吸取亞硫酸氫鈉使用液0.3 mL（相當于15 μg二氧化硫），置于25 mL帶塞比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL、鄰苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸銨1.5 mL，混勻，用水定容至刻度，于50℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，放入冰水中冷卻，靜置30 min后用熒光分光光度計掃描吸收和發(fā)射光譜圖，確定最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長。

1.3.3 試劑配制

亞硫酸氫鈉對照品儲備液：精密稱取亞硫酸氫鈉對照品0.250 0 g，加水溶解定容至100 mL，避光冷藏，備用，使用前按下述方法標定。

吸取10.0 mL亞硫酸氫鈉水溶液于250 mL碘量瓶中，加100 mL水，準確加入20.00 mL碘溶液（0.1 mol/L），5 mL冰乙酸，搖勻，放置于暗處，2 min后迅速以硫代硫酸鈉（0.100 mol/L）標準溶液滴定至淡黃色，加0.5 mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至無色。另取110 mL水，準確加入碘溶液20.0 mL（0.1 mol/L）、5 mL冰乙酸，按同一方法做試劑空白試驗。二氧化硫標準溶液的質(zhì)量濃度計算公式如下：

式中：X—二氧化硫標準溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；V1—亞硫酸氫鈉儲備液消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積，mL；V2—試劑空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積，mL；c—硫代硫酸鈉標準溶液的摩爾濃度，mol/L；32.03—每毫升硫代硫酸鈉標準溶液相當于二氧化硫的質(zhì)量，mg。

亞硫酸氫鈉使用液：臨用前將亞硫酸氫鈉儲備液稀釋成每毫升相當于50 μg二氧化硫。

鄰苯二甲醛溶液：準確稱取鄰苯二甲醛26.82 mg，用無水乙醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，即得。避光冷藏，臨用新配。

乙酸銨溶液：稱取乙酸銨0.3850g，用去離子水溶解，定容至1 000 mL容量瓶中，即得。

磷酸鹽緩沖溶液：準確稱取磷酸氫二鈉2.13 g、磷酸二氫鉀2.04 g，加水溶解后定容至100 mL容量瓶中，即得。

1.3.4 亞硫酸氫鈉標準曲線繪制

吸取亞硫酸氫鈉使用液0、0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL（相當于0、0.5 μg、1.5 μg、2.5 μg、5.0 μg、15.0 μg、25.0 μg二氧化硫），分別置于25 mL帶塞比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL、鄰苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸銨1.5 mL，混勻，用去離子水定容至刻度，于50℃水浴中反應(yīng)5min，取出，放入冰水中冷卻，靜置30min，于1cm的石英比色皿中測定熒光強度。以二氧化硫含量（x）為橫坐標、熒光強度（y）為縱坐標繪制亞硫酸氫鈉標準曲線。

1.3.5 熒光化合物生成及測定[17]

準確稱取樣品2.50 g于50 mL離心管中，40℃水浴振蕩提取后，移取樣品溶液10.0 mL于25 mL帶塞比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL、鄰苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸銨1.5 mL，混勻，用水定容至刻度，于50℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，放入冰水中冷卻，靜置30 min，于1 cm的石英比色皿中測定熒光強度。按照亞硫酸氫鈉標準曲線回歸方程計算樣品中二氧化硫殘留量，其計算公式如下：

式中：X—二氧化硫殘留量，mg/kg；m—測定用試樣中二氧化硫殘留量的質(zhì)量，μg；V1—樣品定容體積，mL；V2—樣液移取體積，mL；M—樣品稱取質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

設(shè)定發(fā)射波長為390nm，掃描激發(fā)波長，激發(fā)光譜分別在波長221 nm和320 nm處出現(xiàn)二個光譜峰，結(jié)果見圖1。設(shè)定激發(fā)波長為221 nm，掃描發(fā)射波長，最大發(fā)射光譜峰在386 nm；設(shè)定激發(fā)波長為320 nm，掃描發(fā)射波長，最大發(fā)射光譜峰在386 nm，結(jié)果見圖2。

圖1 熒光激發(fā)光譜圖Fig.1 Fluorescence of excitation spectra

圖2 熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence of emission spectra

根據(jù)波長掃描確定激發(fā)、發(fā)射波長后，試驗過程中熒光分光光度計參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長、發(fā)射波長221nm、386nm和320nm、386nm，積分時間0.1s，延遲時間0.1 s，激發(fā)波長狹縫寬度5.0 nm，發(fā)射波長狹縫寬度5.0 nm，光電倍增管電壓250 V。

2.2 亞硫酸氫鈉標準曲線繪制

分別在激發(fā)、發(fā)射波長分別為221nm、386nm和320nm、386 nm條件下繪制亞硫酸氫鈉標準曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在0～1 000 μg/L范圍內(nèi)，激發(fā)波長320 nm、發(fā)射波長386 nm條件下，亞硫酸氫鈉標準曲線回歸方程的線性相關(guān)性（0.999 8）優(yōu)于激發(fā)波長221 nm、發(fā)射波長386 nm條件下的線性相關(guān)性（0.984 0），雖然二者在0～600 μg/L范圍內(nèi)有一致的線性相關(guān)性，但是線性范圍變窄。因此，確定最佳激發(fā)、發(fā)射波長分別為320 nm和386 nm。

圖3 亞硫酸氫鈉標準曲線Fig.3 Standard curve of sodium bisulfite

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 方法精密度試驗

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

稱取3個未知二氧化硫殘留量的淀粉各5份進行平行性試驗，結(jié)果見表1。由表1可知，3個二氧化硫殘留量不同的樣品平行性試驗結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均＜10%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.3.2 方法最低檢測限

表2 檢出限測定結(jié)果Table 2 Detection results of limit of detection

由表2可知，連續(xù)11次進空白樣品，根據(jù)3倍標準偏差計算得出本方法二氧化硫檢出限為0.732 mg/kg。

2.3.3 方法加標回收率試驗

稱取已知二氧化硫含量的淀粉3份，精確加入亞硫酸氫鈉對照品溶液適量（相當于加入二氧化硫含量是70 μg），按供試品溶液的制備與測定同法操作，計算二氧化硫加標回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，方法的回收率在95.3%～104.8%之間，說明該檢測方法具有良好的準確性。

表3 加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.3.4 方法穩(wěn)定性試驗

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Results of stability experiments

同一樣品分別放置0、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h后測定一次，分別記錄熒光強度，結(jié)果見表4。由表4可知，高質(zhì)量濃度二氧化硫（30.231 mg/kg）熒光強度與低質(zhì)量濃度二氧化硫（2.405mg/kg）熒光強度在2.0 h內(nèi)均衰減不顯著（P＞0.05），由此可以說明樣品溶液在避光冷藏放置2.0h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 熒光分光光度法與鹽酸副玫瑰苯胺比色法、滴定法比較

淀粉中二氧化硫測定通常采用GB5009.34—2016《食品安全國家標準食品中二氧化硫的測定》中的滴定法以及鹽酸副玫瑰苯胺比色法，而關(guān)于熒光分光光度法測定淀粉中二氧化硫的報道則比較少。故將熒光分光光度法檢測結(jié)果與國標滴定法、鹽酸副玫瑰苯胺比色法的檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果見表5。由表5可知，3種方法的測定結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），且熒光分光光度法精密度更好。由此可見，熒光分光光度法更適合測定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量。

表5 熒光分光光度法與比色法和滴定法比較Table 5 Comparison of fluorescence spectrophotometry with colorimetric method and titrimetry

3 結(jié)論

基于亞硫酸氫鹽、鄰苯二甲醛與銨鹽反應(yīng)生成熒光化合物的原理，本研究建立了熒光分光光度法作為測定淀粉及其衍生物中二氧化硫殘留量的方法，該方法具有靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。標準曲線及方法學(xué)驗證結(jié)果顯示：方法的最低檢測限為0.732 mg/kg，亞硫酸氫鈉標準曲線線性回歸方程y=23.22x+0.854，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；精密度試驗結(jié)果RSD為1.81%～5.16%，加標回收率在95.3%～104.8%之間，溶液在避光冷藏放置2 h內(nèi)穩(wěn)定，熒光分光光度法檢測結(jié)果與GB 5009.34—2016《食品安全國家標準食品中二氧化硫的測定》滴定法及鹽酸副玫瑰苯胺比色法的檢測結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明熒光分光光度法可以作為測定淀粉中二氧化硫殘留量的方法。

[1]余淑.淀粉中二氧化硫殘留量測定的幾種方法比較[J].淀粉工程，2012（1）：81-84.

[2]李利軍，盧美歡，岳淑寧.蒜制品中二氧化硫的檢出、來源及食用安全性分析[J].中國釀造，2010，29（1）：121-122.

[3]王淑艷.蘑菇罐頭中二氧化硫殘留量檢測標準和方法的探討[J].中國公共衛(wèi)生管理，2006，22（1）：40-41.

[4]吳衛(wèi)平，張磊，李潔，等.食品中二氧化硫殘留快速檢測方法的研究[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2006，18（9）：470-471.

[5]李東奇，陳華成，楊雪麗.二氧化硫?qū)C體各組織器官毒性作用的研究進展[J].獸牧獸醫(yī)雜志，2008，27（1）：37-39.

[6]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 2760—2014食品安全國家標準食品添加劑使用標準[S].北京：中國標準出版社，2014.

[7]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5009.34—2016食品安全國家標準食品中二氧化硫的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

[8]李建偉，朱亞民，劉博，等.鹽酸副玫瑰苯胺比色法測定亞硫酸鹽[J].分析實驗室，2001，20（10）：35-37.

[9]STEPHEN W C,BENNY T P C,ANDY C M C.Determination of free and reversibly-bound sulfite in selected foods by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection[J].J AOAC Int,2008,91 (1):98-102.

[10]WANG X H,XIE P S,LAM CHRIS W K,et al.Study of the destructive effect to inherent quality ofAngelicae dahurcaeradix(Baizhi)by sulfurfumigated process using chromatographic fingerprinting analysis[J].J Pharm Biomed Anal,2009,49(5):1221-1225.

[11]王曉云，龔漢卿，王明林.頂空氣相色譜法測定膨化大棗中的亞硫酸鹽含量[J].山東化工，2007，36（1）：36-38.

[12]孫艷平，李濤.頂空氣相色譜-火焰光度檢測器檢測山藥中的二氧化硫[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（8）：1024-1025.

[13]郟征偉，毛北萍，苗水，等.頂空氣相色譜法測定硫黃熏蒸中藥材中二氧化硫的殘留量[J].藥學(xué)學(xué)報，2014，49（2）：277-281.

[14]羅建民，王愛霞，陳俊宇.離子色譜法測定葡萄干中二氧化硫殘留量[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（4）：90-92.

[15]王欣美，夏晶，王柯，等.堿性溶液提取-離子色譜法測定中藥中二氧化硫殘留量[J].中國中藥雜志，2011，36（19）：2656-2659.

[16]HASSON M,UWE S.Sensitive and selective flow injection analysis of hydrogensulfite/sulfurdioxidebyfluorescencedetectionwithandwithout membrane separation by gas diffusion[J].Anal Chem,2001,73(13): 3187-3192.

[17]彭月，李雪蓮，銀玲，等.熒光衍生法測定中藥二氧化硫殘留量研究[J].中國中藥雜志，2013，38（2）：212-215.

Determination of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives by fluorescence spectrophotometry

HU Jiayong,LIU Di,CHENG Yinqi,PENG Qingzhi*
(Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test,Wuhan 430060,China)

The determination method of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives by fluorescence spectrophotometry was established.In weak acid conditions,using the o-phthalaldehyde/ammonium salt as fluorescent indicator,sodium bisulfite as quantitative standard,fluorescence intensity as evaluation index,the sulfur dioxide residue content in simples was determined.The results showed that the linear regression equation of standard curve wasY=23.22X+0.854.The linearly dependent coefficient(R2)was 0.999 8,the limit of detection was 0.732 mg/kg,the adding standard recovery rate was in the range of 95.3%-104.8%,which indicated that the method had good precision and reliable test results.The fluorescence spectrophotometry could be used for determination method of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives.

fluorescence spectrophotometry;colorimetric method;sulfur dioxide residue;starch and its derivatives

O657.31

0254-5071（2017）06-0175-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.036

2017-03-10

胡家勇（1990-），男，助理工程師，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者：彭青枝（1967-），女，研究員，博士研究生，研究方向食品質(zhì)量與安全。