邢媛媛，李紅磊，李大彪，胡紅蓮，張興夫，高 民,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

油酸對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)甘油三酯含量和乳脂肪合成相關(guān)基因表達的影響

邢媛媛1，李紅磊1，李大彪1，胡紅蓮2，張興夫2，高 民1,2*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

本試驗旨在探討油酸對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)甘油三酯含量和乳脂肪合成相關(guān)基因表達的影響。選取中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞（BMECs）為試驗材料，經(jīng)純化培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中添加0（對照）、50、100、200、400 μmol/L油酸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細胞活力；利用試劑盒檢測胞內(nèi)甘油三酯的含量；采用實時定量PCR法檢測乳脂肪合成相關(guān)基因的表達。結(jié)果表明：油酸濃度為200、400 μmol/L時，BMECs相對增殖率顯著低于對照組與其他試驗組（P＜0.05）；添加100、200 μmol/L的油酸促進了胞內(nèi)甘油三酯的合成（P＜0.05）；添加油酸上調(diào)了二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）基因表達量，50 μmol/L的油酸顯著上調(diào)了乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARGγ）基因表達量（P＜0.05），100～400 μmol/L的油酸顯著抑制了硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3）、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）基因表達量。綜上所述，50～100 μmol/L的油酸對BMECs乳脂肪合成具有較好的促進效果。

奶牛乳腺上皮細胞；油酸；細胞活力；甘油三酯；乳脂肪合成相關(guān)基因

油酸作為重要的乳成分合成前體物，能為動物機體提供能量，還能減少血液中膽固醇和甘油三脂的含量、降低血脂、防止高血壓、提高機體免疫力等[1]。關(guān)于泌乳機理的體外研究主要以奶牛乳腺上皮細胞（BMECs）為模型，從基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)揭示油酸對乳脂肪和乳蛋白合成的調(diào)控機理。崔瑞蓮[2]研究發(fā)現(xiàn)，添加200 μmol/L和400 μmol/L油酸會抑制細胞增殖，0～100 μmol/L油酸會促進胞內(nèi)甘油三酯合成。Kadegowda等[3]研究指出，油酸能直接影響B(tài)MECs中脂肪生成基因的表達。乳脂肪合成的調(diào)控是由一個復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)進行的。在這一基因網(wǎng)絡(luò)中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARGγ)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）是調(diào)節(jié)乳脂合成相關(guān)基因重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和核受體，在細胞調(diào)控因子通路中處于樞紐位置，而且PPARG可能調(diào)控SREBP1的表達。而脂肪酸從頭合成基因乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FASN），脂肪酸攝取轉(zhuǎn)運基因脂蛋白脂酶（LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3），脂肪酸合成過程中的硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）等諸多基因圍繞這兩個重要調(diào)控因子，形成一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控乳脂肪的合成[4]。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12、無脂肪酸的牛血清白蛋白、氫化可的松、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液均購自Gibco公司；無水乙醇、表皮生長因子、催乳素、膠原酶Ⅱ、雙抗、胰蛋白酶/EDTA、 MTT和油酸均購自Sigma公司；磷酸緩沖液 （PBS）溶液和胎牛血清購自HyClone公司；基質(zhì)膠（Matrigel）和細胞回收液均購自Corning公司；總RNA提取試劑盒（RNA isoplus）、RTPCR試劑盒（prime scriptTMRT reagent kit）、Real-Time PCR試劑盒均購自 TaKaRa 公司；TAG試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設(shè)計 采用單因子完全隨機試驗設(shè)計。選取健康的中國荷斯坦奶牛的乳腺上皮細胞進行體外培養(yǎng)，經(jīng)純化后，收集第2代的乳腺上皮細胞，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞長滿60%～70%時，添加含有0（對照）、50、100、200、400 μmol/L油酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2 mmol/L谷氨酰胺、1 ng/mL氫化可得松及5 μg/mL胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后收集細胞，提取總RNA，測定濃度，制備RT-qPCR反應(yīng)液，應(yīng)用RT-qPCR方法，檢測乳脂合成相關(guān)基因[乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FASN）、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）、SCD]、乳脂合成相關(guān)轉(zhuǎn)運調(diào)控因子[FABP3、PPARGγ、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）]，各基因表達量用2-△△Ct值表示。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 乳腺上皮細胞培養(yǎng)的獲取與純化 選取處于泌乳高峰期體況良好的荷斯坦奶牛進行試驗，從奶牛乳腺組織取樣，剪取腺泡豐富的乳腺組織約50 g，利用膠原酶Ⅱ消化法獲得原代乳腺上皮細胞。待原代細胞長滿培養(yǎng)瓶底的80%左右時，利用乳腺上皮細胞和成纖維上皮細胞對胰蛋白酶的敏感度不同來純化乳腺上皮細胞并傳代。傳至第1代凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 油酸的配制 將1 g的油酸溶到無水乙醇中，配制成1 mol/L的儲液，-80℃冰箱保存。再按照一定比例將油酸添加到誘導(dǎo)培養(yǎng)液中。為了防止油酸在液體中析出，將油酸單獨添加到牛血清白蛋白中，誘導(dǎo)培養(yǎng)液中牛血清白蛋白的濃度為1 g/L。

1.3.3 BMECs細胞活力的檢測 用MTT法檢測BMECs的增殖能力。將BMECs懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種密度是1×104個/200 μL，將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后添加含不同濃度油酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每個試驗組均設(shè)7個重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h吸出培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后棄去MTT，每孔再加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，490 nm波長下檢測各孔的吸光光度值（OD490）。細胞相對增殖率RGR（Relative Growth Rate）=試驗組OD490/對照組OD490。

1.3.4 BMECs內(nèi)TAG含量的測定 將BMECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶接種量3×105個/5mL。培養(yǎng)24 h后，分別添加含不同油酸濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用0.25%胰蛋白酶/EDTA混合液消化并收集細胞沉淀，用PBS清洗沉淀2遍，再將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，每管加入200 μL的PBS后將BMECs超聲破碎，按照甘油三酯試劑盒給出的方法檢測BMECs胞內(nèi)TAG的含量。

1.3.5 BMECs中乳脂和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達量的測定 將第2代細胞懸浮液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶10 mL含有8×105個細胞，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%匯合后，分別添加含不同濃度油酸的DMEM/F12誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用胰蛋白酶/EDTA消化細胞，將細胞懸液128×g離心10 min，棄去上清液，用PBS清洗，細胞總RNA的提取采用試劑盒按說明書進行，用分光光度計測定提取的總RNA的濃度及OD260/ OD280，反轉(zhuǎn)錄PCR按照試劑盒說明進行操作。本試驗以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，引物序列及參數(shù)見表1。試驗每組設(shè)3個重復(fù)。

表1 引物序列及參數(shù)

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行計算和整理，RT-qPCR試驗結(jié)果采用2－△△Ct法進行相對定量分析。利用SAS 9.0軟件的One-Way ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan's法，以P＜0.05作為差異顯著的判別標準。

2 結(jié) 果

2.1 油酸對BMECs增殖的影響 由表2可知，其中50 μmol/L油酸組BMECs的相對增殖率（RGR）高于對照組趨勢（P＞0.05）。200、400 μmol/L油酸組BMECs的相對增殖率顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.2 油酸對BMECs內(nèi)乳脂合成的影響 由表3可以看出，添加不同濃度油酸均會促進BMECs胞內(nèi)TAG的合成，其中100、200 μmol/L油酸處理組BMECs胞內(nèi)TAG合成量顯著高于對照組及其他處理組（P＜0.05）。

2.3 油酸對BMECs乳脂合成相關(guān)基因表達的影響 由表4可知，添加50 μmol/L油酸ACC基因的表達量顯著高于對照組，而添加100 μmol/L和400 μmol/L的油酸ACC的表達量顯著低于對照組（P＜0.05）。油酸濃度為200 μmol/L時，F(xiàn)ASN的相對表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，油酸處理組上調(diào)了DGAT2的基因表達水平，其中200 μmol/L的油酸處理組DGAT2的基因表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。油酸處理組SCD和FABP3基因表達量顯著低于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，100～400 μmol/L油酸顯著抑制SREBF1基因的表達，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)（P＜0.05）。50 μmol/L的油酸處理組，PPARG的基因表達量顯著高于對照組（P＜0.05），而100、200、400 μmol/L油酸處理組，PPARG的基因表達量則顯著低于對照組（P＜0.05）。

表 2 添加不同濃度油酸對奶牛乳腺上皮細胞增殖能力的影響

表 3 添加不同濃度油酸對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)TAG合成的影響

表 4 添加油酸對奶牛乳腺上皮細胞乳脂肪合成相關(guān)基因表達量的影響

3 討 論

3.1 油酸對BMECs增殖的影響 MTT法檢測細胞增殖能力的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能把MTT還原為不溶性的藍紫色的結(jié)晶甲瓚，并沉積在細胞中，細胞內(nèi)的結(jié)晶數(shù)量與細胞增殖能力呈正比。BMECs的活力是乳脂乳蛋白合成的前提。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著油酸濃度的增加，BMECs的增殖被顯著抑制。孫曉菊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的油酸會抑制BMECs的增殖。崔瑞蓮等[2]研究指出，200、400 μmol/L的油酸會顯著抑制BMECs的增殖。馮小寶[6]研究表明，0～100 nmol/L的油酸能夠促進BMECs的增殖，BMECs對油酸的吸收利用需要蛋白介導(dǎo)的膜轉(zhuǎn)運過程。本試驗與前人研究結(jié)果一致，BMECs的增殖能力與油酸的添加濃度存在劑量依賴關(guān)系。

3.2 油酸對BMECs甘油三酯合成及乳脂肪合成相關(guān)基因表達的影響 乳脂肪是牛奶的風(fēng)味物質(zhì)，其含量影響著牛奶的品質(zhì)。BMECs胞內(nèi)甘油三酯的合成量是評定油酸能否促進乳脂肪合成的重要指標。有研究發(fā)現(xiàn)，在細胞增殖不受抑制的情況下，油酸能促進BMECs胞內(nèi)TAG的合成[2]。Yonezawa等[7]研究表明，向BMECs培養(yǎng)液中添加不飽和脂肪酸，均能促進細胞內(nèi)TAG的沉積。在本試驗條件下，不同濃度的油酸處理組均會促進BMECs內(nèi)TAG的合成，其中100、200 μmol/L的油酸處理組TAG合成量顯著高于對照組，這與前人的研究結(jié)果一致。

乳脂肪作為牛奶中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸在維護人體健康方面扮演著重要的角色。前人針對油酸對乳脂肪合成的影響及其調(diào)控機理也開展了一些研究工作。ACC和FASN是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，Kadegowda等[3]研究發(fā)現(xiàn)，添加長鏈脂肪酸會抑制ACC和FASN的基因表達量。DGAT2是TAG合成的重要基因，在TAG合成過程中必不可少，DGAT2基因沉默或缺失會導(dǎo)致TAG合成效率的降低[8-9]。研究表明，在BMECs培養(yǎng)液中添加一定量的油酸會抑制ACC基因的表達，促進DGAT2基因的表達[2,5]。本試驗發(fā)現(xiàn)，高濃度的油酸會抑制ACC基因的表達，上調(diào)DGAT2基因的表達，DGAT2基因的高表達可能是促進胞內(nèi)TAG沉積的主要原因。

在乳腺組織中SCD 是單不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，SCD可以在碳鏈的Δ9 位置引入雙鍵，使飽和脂肪酸變成不飽和脂肪酸[10]。FABP3是一種結(jié)合長鏈脂肪酸的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，在奶牛乳腺組織中參與脂肪酸的攝取轉(zhuǎn)運。Bionaz等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3主要是為SCD 提供脂肪酸進行乳脂肪的從頭合成。關(guān)于不飽和脂肪酸對SCD和FABP3表達的影響與前人研究結(jié)果不一致。有研究表明，體外培養(yǎng)BMECs添加不飽和脂肪酸會降低BMECs中SCD和FABP3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平[2,5,11]。而Sheng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在BMECs培養(yǎng)液中添加不同配比不飽和脂肪酸會上調(diào)SCD和FABP3的表達。本研究表明，添加油酸處理組會降低SCD和FABP3的表達量。

SREBF-1在反芻動物乳脂合成過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，調(diào)控乳脂合成相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄[13-14]。不飽和脂肪酸會抑制SREBF-1的表達[15-16]。過氧化物酶激活受體（PPAR）是配體激活核受體亞家族，其中PPARG是調(diào)控乳脂肪合成的關(guān)鍵核受體，脂肪酸代謝方面具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[9]。孫曉菊[5]研究發(fā)現(xiàn)，50 μmol/LL的油酸上調(diào)了PPARG的表達量，高濃度的油酸降低了PPARG的表達量。還有研究指出不飽和脂肪酸對 PPARG 基因表達量有下調(diào)的趨勢[3]。Kadegowda等[3]研究指出，SREBF1的表達可能受到PPARG的調(diào)控，PPARG促效劑不但促進其靶基因ACC和FASN的表達，也上調(diào)了SREBF1的基因表達量。本研究得出，添加100 ～

400 μmol/L的油酸顯著抑制了SREBF-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進而抑制其靶基因ACC、FASN和SCD的表達；添加50 μmol/L的油酸上調(diào)了PPARG基因的表達，添加100～400 μmol/L的油酸抑制了PPARG的表達，其原因可能是添加較高濃度的油酸對細胞造成損傷，使細胞膜表面受體及轉(zhuǎn)運基因FABP3表達受阻，阻礙了胞外信號向細胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制了PPARG的表達。添加100～400 μmol/L油酸，SREBF1和PPARG的表達同時被抑制，可能是ACC、FABP3和SCD的表達量降低的主要原因。

乳脂肪和乳蛋白質(zhì)作為牛奶中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，是衡量牛奶品質(zhì)的重要指標。目前我國生鮮乳的乳蛋白和乳脂肪的含量普遍低于發(fā)達國家[5]。深入研究乳成分前體物對泌乳過程的影響并揭示其調(diào)控機理對提高牛奶品質(zhì)有重要意義。根據(jù)前人研究結(jié)果，本試驗以BMECs為試驗?zāi)Ｐ停O(shè)計了不同的添加劑量，進一步研究驗證不同濃度的油酸對細胞活力、甘油三酯合成量和乳脂肪合成及相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，從而篩選油酸的最佳濃度，這在國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)報道，為研究油酸對乳脂肪及乳蛋白合成的調(diào)控機理提供了新的理論依據(jù)。

4 小 結(jié)

本研究表明，由200 μmol/L和400 μmol/L的油酸顯著降低了BMECs的增殖能力。添加50～100 μmol/L的油酸促進了胞內(nèi)TAG的合成，上調(diào)了DGAT2基因的表達。50 μmol/L的油酸顯著上調(diào)了ACC和PPARG的表達。綜上所述，50～100 μmol/L的油酸對BMECs乳脂肪合成具有較好的促進效果。

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Ef f ects of Oleic Acid on Triglyceride Content and Gene Expressions Involved in Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

XING Yuan-yuan1, LI Hong-lei1, LI Da-biao1, HU Hong-lian2, ZHAG Xing-fu2, GAO Min1,2*

The aim othis study was to determine the eects ooleic acid on triglyceride content and gene expressions involved in milkat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs). Mammary epithelial cellsrom Chinese Holstein cows were culture and purication. Dierent concentrations [0(control), 50, 100, 200, 400 μmol/L] ooleic acid were added in culture mediumor a 24 h cultivation. Cell viability was detected by thiazoly blue tetrazolium bramide (MTT); triglyceride (TAG) content was measured by using TAG determination kit; gene expressions involved in milkatsynthesis were measured by real-time quantitative (RT-qPCR). The results showed that 200 μmol/L and 400 μmol/L oleic acid signicantly inhibited the prolieration oBMECs compared with control and other experimental groups (P＜0.05); 100 μmol/L and 200 μmol/L oleic acid signicantly promoted TAG synthesis in BMECs (P＜0.05). SCD, FABP3 and SREBF1 gene expression were signicantly suppressed by addition ooleic acid (P＜0.05), however, DGAT2 gene expression was increased.50 μmol/L oleic acid signicantly increased ACC and PPARGγ gene expression(P＜0.05). In conclusion, 50 to 100 μmol/L oleic acid is an optimal level considering its improvement eects on milkat synthesis.

Bovine mammary epithelial cells; Oleic acid; Cell viability; Triglyceride; Genes related in milkat synthesis

S823.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-056

2016-12-05；

2017-03-27

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CAR S-37）

邢媛媛（1991-），女，內(nèi)蒙古人，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)生理及瘤胃微生態(tài)研究，E-mail:xingyuany uan2014@163.com

* 通訊作者：高民，E-mail: gmyh1588@126.com