張 科，李碧波，楊雨鑫，陳玉林

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

0～56日齡陜北白絨山羊胃腸道組織形態(tài)發(fā)育探究

張 科，李碧波，楊雨鑫，陳玉林*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

本試驗旨在研究0～56 日齡羔羊胃腸道組織形態(tài)隨日齡的發(fā)育變化規(guī)律。試驗選用24只陜北白絨山羊羔羊，按照完全隨機試驗設(shè)計分為8組，每組3只。分別在出生后0、3、7、14、21、28、42、56日齡屠宰、取樣，制作常規(guī)石蠟切片，HE 染色，測定各組織相關(guān)指標(biāo)及胃室發(fā)酵指標(biāo)。結(jié)果表明：在0～56日齡的發(fā)育過程中，陜北白絨山羊瘤胃內(nèi)容物的pH維持在5.35～6.28，皺胃液pH在3.29～4.39；瘤胃背囊乳頭高度從28日齡開始，增速加快；網(wǎng)胃各指標(biāo)呈現(xiàn)增大趨勢；十二指腸絨毛高度在0、3、7、14、28、56 各日齡間差異顯著（P ＜0.05），回腸隱窩深度在0、3、14、42、56各日齡之間差異顯著（P ＜0.05），空腸絨毛高度在0、14、56各日齡之間差異顯著（P ＜0.05）；結(jié)腸的黏膜厚度和肌層厚在0～56日齡過程中發(fā)育顯著。綜上可知，28日齡是陜北白絨山羊胃腸道組織形態(tài)發(fā)育的臨界點。在28日齡后，山羊各項指標(biāo)發(fā)育迅猛加速，幾乎接近56日齡水平，故預(yù)測陜北白絨山羊利用代乳料可實現(xiàn)28 d斷奶。

陜北白絨山羊；解剖；胃腸道、組織切片

反芻動物幼齡時胃腸道的發(fā)育直接影響成年后的采食量及消化能力，羔羊之所以能發(fā)育為反芻動物，歸根結(jié)底在于其瘤胃的發(fā)育[1]。羔羊出生后，從母體、日糧和外界環(huán)境中接觸和獲得微生物，經(jīng)過適應(yīng)和定植，從而引起瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生改變[2]。隨著日齡的增加，瘤胃組織的形態(tài)也會發(fā)生一系列變化。Norouzian等[3]研究發(fā)現(xiàn)，羔羊飼喂干苜蓿作為開食料會降低瘤胃上皮角化層的厚度，增加肌層的厚度，對增重和生長沒有影響。對羔羊而言，干苜蓿是否可作為開食料，瘤胃的發(fā)育至關(guān)重要。瘤胃必須要有足夠的力量、容量、功能性微生物種群和有效的吸收表面來配合開食料的吸收[4]，而羔羊開食料最優(yōu)組合方案目前尚不太清楚。許多研究人員對羔羊開食料的最優(yōu)水平進行了一系列的研究[5]，以滿足羔羊營養(yǎng)需求和器官良好發(fā)育。

小腸是機體進行營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，其健康發(fā)育對機體至關(guān)重要。從其超微結(jié)構(gòu)來看，絨毛高度、隱窩深度及肌層厚度是小腸發(fā)育的重要指標(biāo)[6]。Silva等[7]研究發(fā)現(xiàn)，羔羊采食大豆蛋白后小腸絨毛變短，嚴(yán)重時小腸上皮會發(fā)生脫落。前人的諸多研究主要集中在對開食料、斷奶日齡、菌種制劑、蛋白質(zhì)水平等因素對羔羊發(fā)育的影響，對56日齡之前的各個階段胃腸道指標(biāo)進行比較分析尚未報道。本試驗主要比較分析0、3、7、14、21、28、42、56日齡羔羊各胃室、小腸、大腸的超微結(jié)構(gòu)發(fā)育指標(biāo)，從而為羔羊早期斷奶和制定合理的開食料最優(yōu)水平方案提供理論基礎(chǔ)，推動陜北白絨山羊后續(xù)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗羔羊在2016年4月飼養(yǎng)于陜西省榆林市陜北白絨山羊種羊場。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 選擇初生體重相近的羔羊24只，分別于出生后0、3、7、14、21、28、42、56日齡屠宰、取樣（各日齡3只），屠宰過程符合動物福利規(guī)程。在0日齡被屠宰的羔羊出生后立即與母羊隔離、不進行哺乳，其余階段羔羊隨母羊舍飼并自由哺乳，25日齡開始隨母羊自由采食精料及優(yōu)質(zhì)苜蓿（精料配方見表1），飼喂的苜蓿產(chǎn)于榆林當(dāng)?shù)?，自由飲水，宰前不禁食?/p>

表1 試驗動物日糧組成與營養(yǎng)成分

1.3 樣品采集及分析測定 將待采樣的羔羊進行拍照與稱重，測量體高及體斜長，用4 %戊巴比妥鈉將羔羊完全麻醉，立即剖開腹腔，迅速結(jié)扎各胃室及腸道分界處，并用剪刀連續(xù)取下1 cm2組織，用生理鹽水沖洗殘余內(nèi)容物后，迅速將其浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，按常規(guī)方法制作石蠟切片，進行HE 染色。其次，測定瘤胃和皺胃的pH，并采集瘤胃內(nèi)容物，根據(jù)次氯酸鈉比色法[8]測定瘤胃液中氨態(tài)氮（NH3-N）的含量。

1.3.1 瘤胃和皺胃pH測定 采樣后立即用PHB-2型便攜式pH計測定瘤胃和皺胃內(nèi)容物pH。

1.3.2 胃腸道組織形態(tài)學(xué)觀察 胃腸道各段的固定樣品經(jīng)過HE染色后，在4×10倍顯微鏡下觀測各形態(tài)指標(biāo)的變化。每個樣本觀察2個非連續(xù)切片，每張切片選取3個視野，每個視野分別測定10組數(shù)據(jù)，其平均值作為1個測定數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗最終數(shù)據(jù)經(jīng)過Microsoft Excel（2013）初步統(tǒng)計后，運用SPSS（21.0）分析軟件中One-Way ANOVA進行差異顯著性分析，多重比較用Ducan's法進行。P＜0.05表示差異顯著。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃、皺胃pH及瘤胃液NH3-N的含量 由表2可知，在0～56日齡的發(fā)育過程中，瘤胃內(nèi)容物的pH有降低的趨勢，但基本維持在5.35～6.28，而皺胃液pH保持在3.29～4.39。瘤胃液中NH3-N的含量在0～42日齡沒有顯著差異（P＞0.05），在56日齡時升高至4.01 mg/100 mL。

表2 0～56日齡羔羊瘤胃、皺胃pH及瘤胃液NH3-N的含量的變化

2.2 0～56日齡羔羊各胃室組織形態(tài)發(fā)育變化

2.2.1 0～56日齡羔羊瘤胃背囊組織形態(tài)發(fā)育變化 由圖1A可知，瘤胃背囊乳頭高度隨著日齡的增加逐步增高，特別是從28日齡開始，增速迅猛，7日齡之前，瘤胃背囊乳頭高度之間差異不顯著（P＞0.05）。乳頭寬度也呈現(xiàn)逐漸增寬的趨勢，瘤胃肌層厚隨著日齡的增加逐步增厚，且從28日齡開始采食粗飼料后顯著增厚（P＜0.05）。固有層同樣呈現(xiàn)逐步增寬的趨勢，但是在42日齡之前增速較慢，之后增寬迅速。羔羊的角化層是從14日齡開始，隨著飼草的進食，逐步增厚。

2.2.2 0～56日齡羔羊網(wǎng)胃頸組織形態(tài)發(fā)育變化 由圖1B可知，網(wǎng)胃頸組織各項指標(biāo)隨著日齡的增加而逐步增大。初級皺襞高度從28日齡開始增速變快，0、21、42、56日齡的初級皺襞高度差異顯著（P ＜0.05）；皺襞寬度0～14日齡不斷下降，14日齡后逐漸增加，但未達到初始水平；固有層在0～3日齡逐漸變窄，從3日齡開始逐步增寬；肌層增速從21日齡開始增高，但是在42日齡有所降低，0、14、28、56日齡的肌層厚度差異顯著（P ＜0.05）；角化層從21日齡開始出現(xiàn)，并呈現(xiàn)逐步加厚的趨勢，特別是21日齡之后，增厚速度加快，21、42、56日齡的角化層差異顯著（P ＜0.05）。

圖1 羔羊各胃室組織形態(tài)發(fā)育折線圖

2.2.3 0～56日齡羔羊網(wǎng)胃底組織形態(tài)發(fā)育變化 根據(jù)圖1C可以看出，初級皺襞高度隨著日齡增加呈現(xiàn)增高的趨勢，0、3、7、28、42、56日齡的初級皺襞高度差異顯著（P ＜0.05）；皺襞寬度也隨日齡增加而增寬，0、7、56日齡的皺襞寬度差異顯著（P ＜0.05），生長最快階段從21日齡開始，但是7日齡的初級皺襞高度和皺襞寬度都較3日齡有所降低；固有層和肌層隨日齡的增加呈現(xiàn)增加的趨勢，但3、42日齡較前一日齡數(shù)據(jù)有所降低；角化層從21日齡開始出現(xiàn)，并逐漸增厚，較網(wǎng)胃頸的增速慢，21、28、42、56日齡的角化層厚度差異顯著（P ＜0.05）。

2.2.4 0～56日齡羔羊瓣胃和皺胃組織形態(tài)發(fā)育變化由圖1D可知，瓣胃的中央肌層隨著日齡逐步增寬，0、14、21、42、56日齡的中央肌層寬度依次增大（P ＜0.05），0～14日齡、21～28日齡羔羊的中央肌層寬度均無顯著差異（P＞0.05），但隨著日齡的增加呈現(xiàn)增大的趨勢；角化層從42日齡開始出現(xiàn)；皺胃黏膜層厚和皺胃肌層沒有明顯變化規(guī)律，各日齡之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 0～56日齡陜北白絨山羊羔羊小腸組織形態(tài)發(fā)育變化

2.3.1 0～56日齡十二指腸組織形態(tài)發(fā)育變化 由圖2A可知，十二指腸絨毛高度呈現(xiàn)增高的趨勢，0、3、7、14、28和56日齡之間差異顯著（P＜0.05），42日齡出現(xiàn)絨毛高度降低的現(xiàn)象。絨毛寬度隨日齡的增加逐步增寬，0、28、56日齡之間差異顯著（P＜0.05）。隱窩深度、肌層厚度也隨日齡逐步增加，0、7、21、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。絨毛高度與隱窩深度的比值隨日齡降低。

2.3.2 0～56日齡回腸組織形態(tài)發(fā)育變化 由圖2B可知，回腸絨毛高度呈現(xiàn)增高的趨勢，21日齡之后絨毛高度降低的現(xiàn)象，從42日齡開始又逐步增高。絨毛寬度隨日齡的增加逐步增寬，0、7、21、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05），28日齡和42日齡出現(xiàn)寬度變窄的現(xiàn)象，56日齡開始恢復(fù)。隱窩深度也隨日齡逐步變深，0、3、14、42、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。肌層厚度逐步增厚，0、14、42、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。絨毛高度與隱窩深度的比值隨日齡降低的趨勢，但3、7、14日齡較0日齡比較有所上升，14日齡之后比值逐步下降。

圖2 羔羊小腸組織形態(tài)發(fā)育折線圖

2.3.3 0～56日齡空腸組織形態(tài)發(fā)育變化 由圖2C可知，空腸絨毛高度隨日齡逐步增高，0、14、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。絨毛寬度隨日齡的增加逐步增寬，0、7、21、56日齡之間差異顯著（P＜0.05）。隱窩深度也隨日齡逐步變深，0、3、7、28、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。肌層厚度逐步增厚，0、3、7、14、21、28和42各日齡之間差異不顯著（P＞0.05）。絨毛高度與隱窩深度的比值隨日齡降低的趨勢，但在3日齡后各日齡之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 0～56日齡羔羊大腸各段組織形態(tài)發(fā)育變化 根據(jù)表3可得，大腸各段黏膜層厚隨日齡逐漸變厚。盲腸段黏膜層厚0、3、7、21、28、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）；結(jié)腸段黏膜層厚0、7、42、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）；直腸段黏膜層厚0、28、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。盲腸段、結(jié)腸段肌層厚0、21、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）；直腸段肌層厚0、28、56各日齡之間差異顯著（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 羔羊日齡對瘤胃、皺胃pH及瘤胃液NH3-N的含量的影響 Van Soes[9]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中分解纖維素的微生物的最佳生長pH在6.2～7.2。pH是衡量瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，受發(fā)酵酸的合成量、瘤胃壁吸收效率、飼料類型、唾液分泌量和食糜排空速度等諸多因素影響。Silper等[10]對犢牛飼喂代乳品，從30日齡開始瘤胃pH下降。本試驗中瘤胃pH基本上都保持在6.0左右，與Silper等[10]試驗結(jié)果基本一致，但本試驗中56日齡的羔羊瘤胃pH在5.3左右，可能是由于精料采食太多導(dǎo)致。在整個試驗過程中，皺胃的pH保持在3.0～5.0。

表 3 羔羊大腸組織形態(tài)各指標(biāo)隨日齡的變化 mm

瘤胃中NH3-N的含量由飼料中含氮物質(zhì)分解和內(nèi)源氮共同形成，NH3-N是瘤胃微生物合成菌體蛋白的重要前提物，其濃度反映了瘤胃對氮分解和利用的動態(tài)平衡。NH3-N濃度過高說明瘤胃微生物降解氮源釋放氨氣的速率超過了微生物利用氨氣合成自身蛋白質(zhì)的速率，這會增加瘤胃單循環(huán)中氮素的損失，而NH3-N濃度過低會降低MCP的合成效率[7]。從試驗結(jié)果來看，瘤胃中NH3-N含量在56日齡高于其他各日齡水平，在其他各日齡階段基本保持平穩(wěn)。

3.2 羔羊日齡對各胃室組織形態(tài)發(fā)育的影響 最近幾年，研究人員對瘤胃微生物區(qū)系各方面做了大量的研究。Han等[11]研究發(fā)現(xiàn)，年齡能夠顯著影響瘤胃微生物區(qū)系的變化，且在屬水平上的微生物群落變化與年齡有關(guān)。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，從7日齡到2歲，山羊瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生了重大變化來適應(yīng)日齡和采食的變化。以上一系列研究成果證實，日齡與瘤胃本身組織形態(tài)的發(fā)育息息相關(guān)，隨著日齡增長山羊通過改變自身的組織形態(tài)來達到改變自身所涉及的瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)?？v觀各胃室組織形態(tài)指標(biāo)可以看出，28日齡是復(fù)胃發(fā)育的重要臨界點，隨著年齡的增長，采食食物逐步由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，黏膜上皮逐步出現(xiàn)角質(zhì)化，肌層厚度隨日齡增加，從而適應(yīng)粗飼料的攝入對胃室蠕動的改變。其次瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃3者角質(zhì)化時間不同是由于飼草進入消化道的先后順序有差異。這一結(jié)果與丁莉[13]的研究結(jié)果一致。

3.3 羔羊日齡對小腸組織形態(tài)發(fā)育的影響 小腸上皮細胞的發(fā)展和小腸絨毛結(jié)構(gòu)的變化決定了小腸消化和吸收能力，絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度（V/C）是衡量小腸消化功能的重要指標(biāo)，其值決定小腸是否健康的發(fā)育。隱窩深度反映了細胞的生產(chǎn)率，隱窩變淺，表明細胞成熟率上升，分泌功能增強。V/C綜合反映了小腸的功能狀態(tài)，比值下降，表示消化功能下降腸伴有腹瀉；比值上升，說明腸內(nèi)膜面積較大，消化吸收能力較強[13]。本研究結(jié)果表明，隨著日齡的增長，十二指腸、空腸和回腸的V/C下降，主要是因為絨毛高度的增長慢于隱窩深度的加深造成的。另外，十二指腸和回腸的絨毛高度在21～42日齡呈現(xiàn)下降趨勢，可能是在這一階段纖維采食量上升影響腸絨毛的生長并導(dǎo)致脫落。就V/C而言，在0、28、56日齡，十二指腸＞空腸＞回腸，說明十二指腸的吸收能力大于空腸和回腸。單純就隱窩深度而言，也呈現(xiàn)上述規(guī)律。

3.4 羔羊日齡對大腸組織形態(tài)發(fā)育的影響 大腸黏膜光滑、無環(huán)形皺襞，但有縱行皺襞、無腸絨毛、黏膜上皮由單層柱狀細胞和大量杯狀細胞組成，大腸腺發(fā)達，固有層內(nèi)纖維成分多、淋巴小結(jié)豐富，直腸壁內(nèi)纖維不明顯[14]。大腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對宿主有著重要的生理功能，如抗病原微生物、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道功能、維持體液和電解質(zhì)平衡、給宿主尤其是結(jié)腸上皮細胞提供能量等[15]。本研究結(jié)果顯示，大腸各段黏膜層厚度、肌層厚度，0日齡時均為盲腸＞直腸＞結(jié)腸，28日齡時盲腸＞結(jié)腸＞直腸，而到56日齡時結(jié)腸＞盲腸＞直腸。所以，結(jié)腸在整個階段發(fā)育是最快的，說明結(jié)腸的作用隨著日齡的增長日益凸顯。

4 小 結(jié)

本試驗結(jié)果顯示，28日齡是各胃室、小腸各段、大腸各段組織形態(tài)發(fā)育的臨界時期，28日齡之后各項指標(biāo)水平幾乎接近56日齡，故可預(yù)測陜北白絨山羊利用代乳料或營養(yǎng)水平豐富的開食料可實現(xiàn)28日齡斷奶。但具體瘤胃和小腸及大腸各段微生物菌群的發(fā)育是否完善仍需要進一步研究。

[1] 王世琴. 補飼料 NDF 水平對哺乳羔羊消化道發(fā)育的影響[D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[2] 魏德泳, 朱偉云, 毛勝勇. 日糧不同 NFC/NDF 比對山羊瘤胃發(fā)酵與瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 45(7): 1392-1398.

[3] Norouzian M A, Valizadeh R, Vahmani P. Rumen development and growth of Balouchi lambs oered alfalfa hay pre-and post-weaning[J]. Trop Anim Health Pro, 2011, 43(6): 1169-1174.

[4] Steele M A, AlZahal O, Hook S E, et al. Ruminal acidosis and the rapid onset of ruminal parakeratosis in a mature dairy cow: a case report[J]. Acta Vet Scand, 2009, 51(1): 1.

[5] 汪曉娟, 劉婷, 李發(fā)弟, 等. 開食料補飼日齡對羔羊瘤胃和小腸組織形態(tài)的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(4): 172-178.

[6] 柴建民. 斷母乳日齡對羔羊生長性能與胃腸道發(fā)育的影響[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2015.

[7] Silva A G, Huber J T, Herdt T H, et al. Morphological alterations of small intestinal epithelium of calves caused by feeding soybean protein[J]. J Dairy Sci, 1986, 69(5): 1387-1393.

[8] 馮宗慈, 高民. 通過比色測定瘤胃液氨氮含量方法的改進[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2010, (6): 37-37.

[9] Van Soest P J. Nutritional Ecology of the Ruminant[M]. New York U S: Cornell University Press, 1994.

[10] Silper B F, Lana A M Q, Carvalho A U, et al. Effects of milk replacer feeding strategies on performance, ruminal development, and metabolism of dairy calves[J]. J Dairy Sci, 2014, 97(2): 1016-1025.

[11] Han X, Yang Y, Yan H, et al. Rumen bacterial diversity of 80 to 110-day-old goats using 16S rRNA sequencing[J]. PLoS One, 2015, 10(2): e0117811.

[12] Wang L, Xu Q, Kong F, et al. Exploring the goat rumen microbiome from seven days to two years[J]. PLoS One, 2016, 11(5): e0154354.

[13] 丁莉. 關(guān)中奶山羊周歲前消化系統(tǒng)發(fā)育規(guī)律的研究[D].楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2007.

[14] 鄒琦, 周曉禹. 黃羊胃腸組織形態(tài)學(xué)研究[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999, 27(4): 57-59.

[15] 朱偉云, 余凱凡, 慕春龍, 等. 豬的腸道微生物與宿主營養(yǎng)代謝[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報, 2014, 26(10): 3046-3051.

Morphological Development of Gastrointestinal Tissue in Shanbei White Cashmere Goats at the Age 0～56 Days

ZHANG Ke, LI Bi-bo, YANG Yu-xin, CHEN Yu-lin*

This experiment was to study the morphology development characteristics ogastrointestinal tissues in lambs at dierent day ages ater birth. 24 Shanbei White Cashmere Goats were divided into 8 groups according to the completely random experiment designs (n=8). Gastrointestinal contents and tissues were sampled ater the lambs were slaughtered at ages othe birth day 0, 3, 7, 14, 21, 28, 42 and 56. Paran section by conventional method and HE staining was then prepared to determine development characteristics and related parameters ovarious tissue biopsies stomach chamberermentation index. The results show thatrom day 0 to day 56, rumen pHluctuated at a range o5.35 ～ 6.28, and abomasum pH value ranged 3.29 ～ 4.39. The papilla height othe dorsal sac rumen gradually increased with the lamb growth, The indicators oreticulum morphological presented a trend ogradual increase with the lamb growth. The duodenum villus height diered in 0, 3, 7, 14, 28 and 56 days (P ＜ 0.05); Ileal crypt depth also presented a signicant dierence in 0, 3, 14, 42 and 56 days (P ＜ 0.05);Jejunum villus height diered only in 0, 14 and 56 days (P ＜ 0.05). In conclusion, the 28-day-old was a critical point ogastrointestinal tissue morphological development and its development extent was close to that o28-56 days, implicating that Shaanbei White Cashmere Goat could be weaned with a supply omilk replacer at the age o28 day-old weaning by using.

Shanbei white cashmere goats; Anatomy; Gastrointestinal tract; Tissue sections

S827.3

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-072

2016-10-26；

2017-01-09

國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40-13）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303059）

張科（1993-），男，甘肅會寧人，碩士，主要從事瘤胃微生物研究，E-mail: zhangke0702@foxmail.com

* 通訊作者：陳玉林，教授，E-mail：chenyulindk@163.com