李旭新 巴根那 楊恒山 孫德智 包金花

摘要 [目的]通過對肋柱花花粉不同培養(yǎng)條件和測定方法進(jìn)行研究，篩選出適宜花粉萌發(fā)的條件，找出簡單快速測定肋柱花花粉活力方法。[方法]采用離體萌發(fā)法對不同濃度蔗糖、硼酸及培養(yǎng)溫度下花粉萌發(fā)率進(jìn)行研究，并通過醋酸洋紅染色法、TTC染色法及I2-KI染色法對花粉活力進(jìn)行測定。[結(jié)果]肋柱花花粉在蔗糖濃度為15%、硼酸濃度為100 mg/L、溫度為25 ℃培養(yǎng)下，花粉萌發(fā)率達(dá)最大值，超過此條件萌發(fā)率下降。與醋酸洋紅法和 TTC 法相比，I2-KI 染色法的測定結(jié)果與離體培養(yǎng)萌發(fā)法結(jié)果相近。[結(jié)論]適宜肋柱花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)條件為15%蔗糖+100 mg/L硼酸，溫度為25 ℃；I2-KI 染色法可作為肋柱花花粉活力快速測定的最佳方法。

關(guān)鍵詞 肋柱花；花粉萌發(fā)；蔗糖；硼酸；花粉活力

中圖分類號 S567.21+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0127-03

Comparison on Pollen Germination and Viability Determination Method of Lomatogonium rotatum

LI Xu-xin1， BA Gen-na2，YANG Heng-shan1 et al

（1.College of Agronomy， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao，Inner Mongolia 028042；2.College of Mongolia Medicine，Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao，Inner Mongolia 028042）

Abstract [Objective] The optimum conditions of Lomatogonium rotatum of pollen germination were studied by selecting different culture conditions and determination methods， and find a simple and rapid method to determine the pollen viability of Lomatogonium rotatum. [Methods]The germination rate of pollen germination at different concentrations of sucrose， boric acid and culture temperature was studied by in vitro germination method. The pollen viability was determined by carmine acetate staining method， TTC staining and I2-KI staining.[Result] The pollen germination rate reached the maximum at the concentration of 15% sucrose，100 mg/L boric acid and 25 ℃ culture condition， and above this condition，the germination rate decreased.Compared with carmine acetate staining method and TTC method， the determination results of I2-KI staining and in vitro germination method were similar.[Conclusion]The optimum conditions for the pollen germination were 15% sucrose+100 mg/L boric acid，the temperature is 25 ℃.I2-KI staining method can be used as the best method for rapid determination of pollen viability.

Key words Lomatogonium rotatum；Pollen germination；Sucrose；Boric acid；Pollen viability

肋柱花（Lomatogonium rotatum），別名哈比日根-地格達(dá)，屬于一年生野生草本植物，為龍膽科肋柱花[Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym.]的干燥全草，主要用于協(xié)日熱、瘟疫、流感、肝膽熱、黃疸等病癥[1]，其根、全草、葉、花中均含有齊敦果酸（oleanolic acid）[2]，具有降低轉(zhuǎn)氨酶作用，對病毒性肝炎有顯著治療作用。在我國內(nèi)蒙古、黑龍江、河北等地的灌叢草甸、河灘草地、高山草甸等有零星分布，但生長期短且較慢，目前臨床上所使用肋柱花藥源全部采自野生植株，由于其為全草入藥，采集者往往將正處于花期的整株挖走，而留下的植株多數(shù)在種子未成熟時在草原秋季打草（8月中旬）時連同草也一起被割走，草地上存留的肋柱花種子很少，這導(dǎo)致其種群個體數(shù)量急劇下降，資源越來越少。關(guān)于肋柱花的研究主要在提取工藝[1，3-4]和化學(xué)成分[5-6]等方面，而花粉萌發(fā)方面鮮見報道?；ǚ刍盍χ参镉N工作具有重要的作用，篩選適宜的花粉活力測定方法，這對提高植物繁殖效率具有重要的指導(dǎo)作用。該試驗(yàn)以肋柱花花粉為材料，研究不同蔗糖、硼酸濃度及培養(yǎng)溫度對肋柱花花粉萌發(fā)的影響，試圖篩選出適宜花粉萌發(fā)的培養(yǎng)條件，并通過不同染色方法對花粉活力進(jìn)行測定，找出簡單快速測定花粉活力的方法，進(jìn)一步為肋柱花有效繁殖和育種工作提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年8月中旬將采集的肋柱花植株花序放在硫酸紙上，待花粉從花藥內(nèi)散出后，將花粉裝入紙形管中用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蔗糖濃度試驗(yàn)。

采用培養(yǎng)基法對花粉進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。在100 mL蒸餾水內(nèi)加入1 g瓊脂后，再分別添加不同濃度蔗糖（5%、10%、15%、20%），以不加蔗糖為對照（CK）。共同置于燒杯中加熱煮沸，使瓊脂和蔗糖充分溶解于水中，之后用玻璃棒蘸少量培養(yǎng)基于載玻片上，放置片刻使其冷凝作為播種花粉的發(fā)芽床。用毛筆蘸少量花粉，輕輕散落培養(yǎng)基表面，每一視野（10×10）中分布有100～200?；ǚ蹫橐恕⑤d玻片放于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每一處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)觀察4個視野，每個視野不少于100粒花粉，7 h后觀察并統(tǒng)計花粉萌發(fā)數(shù)。花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)以花粉管伸長長度超過花粉粒直徑為準(zhǔn)，計算萌發(fā)率。花粉萌發(fā)率=（花粉萌發(fā)數(shù)/花粉總數(shù)）×100%。

1.2.2 硼酸濃度試驗(yàn)。

利用“1.2.1”篩選出的蔗糖濃度，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度硼酸（50、100、200、300 mg/L），以不加硼酸為對照（CK），按“1.2.1”蔗糖培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)、觀察和統(tǒng)計，篩選適宜肋柱花花粉萌發(fā)的硼酸濃度。

1.2.3 溫度對花粉萌發(fā)的影響。

利用“1.2.1”和“1.2.2”中篩選出的蔗糖和硼酸濃度，分別將花粉在15、20、25、30、35 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察花粉萌發(fā)情況，計算花粉萌發(fā)率。

1.2.4 不同測定方法下花粉活力比較。

（1）氯化三苯基四氮唑（ TTC）染色法[7]。取少量花粉放在載玻片上，加1～2滴TTC溶液，蓋上蓋玻片后將制完的片子放入培養(yǎng)皿內(nèi)，置于35 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，20 min后觀察花粉染色情況。染成紅色的花粉活力較強(qiáng)，無色的為不具有活力花粉。

（2）I2-KI染色法[7]。取少量花粉放在載玻片上，再加1～2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察，凡被染成藍(lán)色的表示花粉具有生活力，呈黃褐色的為無活力花粉。

（3）醋酸洋紅染色法[8]。取少量花粉放在載玻片上，滴上 1～2 滴醋酸洋紅，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。凡是被染成紅色的花粉粒則為有活力。

（4）離體萌發(fā)法。利用“1.2.1”篩選出的蔗糖濃度，將花粉播種在培養(yǎng)基上，于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，觀察花粉萌發(fā)情況。

以上染色方法每一處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)觀察4個視野，每個視野不少于100?；ǚ?，統(tǒng)計花粉活力。花粉活力=花粉染色總數(shù)/觀察花粉總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用 SPSS 13.0 分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔗糖濃度對肋柱花花粉萌發(fā)的影響

從圖1可看出，在蔗糖濃度為0（CK）～15%時，花粉萌發(fā)率呈逐漸升高的變化趨勢，其中在蔗糖濃度為15%時，肋柱花花粉萌發(fā)率達(dá)83.97%，顯著高于對照（P<0.05），為對照的2.56倍；蔗糖濃度超過15%時，花粉萌發(fā)率開始下降。因此，肋柱花花粉萌發(fā)適宜的蔗糖濃度為15%。

2.2 不同硼酸濃度對肋柱花花粉萌發(fā)的影響

從圖2可以看出，不同硼酸濃度培養(yǎng)下，肋柱花花粉萌發(fā)率有一定差異。硼酸濃度在0（CK）～100 mg/L時，隨著濃度的增加，肋柱花花粉萌發(fā)率呈逐漸升高的變化，其中硼酸濃度達(dá)100 mg/L時，花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為89.98%，顯著高于對照12417%（P<0.05），濃度超過100 mg/L時，花粉萌發(fā)率開始下降。當(dāng)硼酸濃度為300 mg/L時，花粉萌發(fā)率顯著低于對照（P<0.05），比對照下降了46.86%。因此，硼酸濃度為100 mg/L最適宜肋柱花的花粉萌發(fā)。

2.3 不同培養(yǎng)溫度對花粉萌發(fā)的影響

由圖3可知，肋柱花花粉在不同溫度培養(yǎng)下，花粉萌發(fā)率有所差異。培養(yǎng)溫度在15～25 ℃時，花粉萌發(fā)率隨溫度升高逐漸升高；其中在25 ℃培養(yǎng)溫度下，花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值（77.38%），顯著高于對照（P<0.05）；當(dāng)溫度高于25 ℃時，花粉萌發(fā)率開始逐漸下降，溫度達(dá)35 ℃時，花粉萌發(fā)率僅為5.76%，顯著低于對照8445%。因此，25 ℃培養(yǎng)條件適宜肋柱花花粉萌發(fā)。

2.4 不同測定方法下花粉活力比較

從4種方法對肋柱花花粉活力測定結(jié)果（圖4）來看，花粉活力從高到低依次為離體萌發(fā)法≥I2-KI測定法>TTC染色法>醋酸洋紅染色法。其中采用TTC染色法和醋酸洋紅染色法測定花粉活力較低，花粉活力分別為21.79%和10.73%，而I2-KI染色法和離體萌發(fā)法測定花粉活力無顯著性差異（P>0.05），花粉活力均達(dá)到80%以上。

3 結(jié)論與討論

花粉萌發(fā)除與本身內(nèi)在因素有關(guān)，還受許多外在條件限制，其中在花粉萌發(fā)過程中的培養(yǎng)條件（蔗糖、硼酸及溫度）對花粉萌發(fā)有一定影響。在花粉萌發(fā)過程中，一方面蔗糖作為主要的碳源，提供花粉萌發(fā)所需要能量，另一方面也可以調(diào)節(jié)花粉與培養(yǎng)液之間滲透平衡。以往關(guān)于蔗糖對花粉萌發(fā)的研究較多，不同植物花粉萌發(fā)對蔗糖濃度的需要不同，如韓成剛等[9]研究芍藥花粉活力得出，100 g/L蔗糖適宜花粉萌發(fā)；王仲等[10]通過對金銀忍冬花粉萌發(fā)測定，發(fā)現(xiàn)最適宜的離體萌發(fā)蔗糖濃度為15%；王存綱等[11]研究得出20 mg/L 蔗糖適宜刺槐花粉萌發(fā)。該試驗(yàn)對肋柱花花粉培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度為15%時，花粉萌發(fā)率達(dá)83.97%，濃度過低或過高均不利于花粉萌發(fā)，因此適于肋柱花花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為15%。

硼酸主要參與花粉管頂端細(xì)胞壁的構(gòu)建[12]，是對花粉活力具有顯著作用和廣泛效果的礦質(zhì)元素之一[13]。而關(guān)于硼酸濃度對花粉萌發(fā)普遍認(rèn)為較低濃度硼酸可以促進(jìn)花粉萌發(fā)[14-15]。該試驗(yàn)采用不同濃度硼酸對花粉進(jìn)行培養(yǎng)后得出，較低濃度（100 mg/L）硼酸有利于肋柱花花粉萌發(fā)，而超過此濃度，花粉萌發(fā)率將下降，因此肋柱花花粉萌發(fā)較適宜的硼酸濃度為100 mg/L。于璐等[16]利用花粉離體萌發(fā)法篩選出最適番茄花粉萌發(fā)的培養(yǎng)溫度是 25 ℃；李勇軍等[17]研究魔芋花粉萌發(fā)條件得出，適宜花粉培養(yǎng)溫度為 26～28 ℃。該試驗(yàn)中，肋柱花花粉在25 ℃ 培養(yǎng)時，花粉萌發(fā)率達(dá)7738%，隨著培養(yǎng)溫度的升高，花粉萌發(fā)率逐漸下降，當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃時，花粉萌發(fā)受到抑制，因此適宜肋柱花花粉的萌發(fā)溫度為25 ℃。

以往研究表明，離體萌發(fā)法因?qū)ǚ刍盍Φ臏y定結(jié)果最接近真實(shí)值而被廣泛使用[18]，但采用離體萌發(fā)法進(jìn)行培養(yǎng)，一般需要前期摸索。該試驗(yàn)分別對5個蔗糖、硼酸濃度及培養(yǎng)溫度進(jìn)行篩選，得出適宜肋柱花花粉萌發(fā)的條件為15%蔗糖+100 mg/L硼酸，在溫度為25 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，花粉萌發(fā)率較高，而這一過程操作起來較繁瑣。相對于離體萌發(fā)法，染色法對花粉活力測定具有簡單和快捷的優(yōu)點(diǎn)，但不同植物花粉適宜的染色方法不同，該研究中I2-KI測定法結(jié)果與離體萌發(fā)法較接近，而且操作簡單，是測定肋柱花花粉活力最適宜的方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 王秀梅，巴根那，白明綱.高效液相色譜法測定肋柱花中獐牙菜苦苷的含量[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，22（3）：320-322.

[2] 白翠蘭，巴根那，王秀蘭.蒙藥肋柱花的鑒別研究[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2002（4）：236-237.

[3] 王振旺，龍平，張春紅，等.HPLC測定肋柱花中獐牙菜苦苷和當(dāng)藥黃素的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：106-108.

[4] 劉婷，高優(yōu)恒，葛春娟，等.響應(yīng)面法優(yōu)化蒙藥肋柱花總黃酮超聲提取工藝[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，39（6）：502-507.

[5] 賈凌云，袁久志，孫啟時.蒙藥肋柱花化學(xué)成分的分離與鑒定（2）[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28（4）：260-262.

[6] 葉日貴，白梅榮，包明蘭，等.蒙藥肋柱花化學(xué)成分的研究[J].北方藥學(xué)，2014，11（12）：20-21.

[7] 張志良，瞿偉菁，李小方.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2009：181-182.

[8] 王定康，孫桂芳，郭志明，等.滇重樓的花粉活力測定方法比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（35）：11451，11453.

[9] 韓成剛，蓋樹鵬.芍藥花粉活力測定方法的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：124-125，126.

[10] 王仲，邵紅，孫睿，等.金銀忍冬花粉生活力測定方法的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（12）：22-24.

[11] 王存綱，晉佳路.刺槐花粉生活力測定方法及貯藏特性[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，45（8）：1443-1446.

[12] 胡適宜.被子植物胚胎學(xué)[M].北京：人民教育出版社，1982：103-136.

[13] 齊曉燕，張廣忠，張新春，等.硼酸對桃花粉萌發(fā)的影響[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2013（8）：6-8.

[14] 李旭新，張艷青，馮獻(xiàn)賓，等.不同培養(yǎng)條件對黃連木花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響[J].西北植物學(xué)報，2009，29（5）：951-956.

[15] 劉鵬，張?zhí)踹B春，等.牛角瓜花粉離體萌發(fā)研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2015，33（2）：142-148.

[16] 于璐，蔣芳玲，周蓉，等.培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)溫度對引進(jìn)番茄品種花粉活力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：110-113.

[17] 李勇軍，王玲，陳建華，等.魔芋花粉離體萌發(fā)及花粉管生長的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，24（6）：2316-2320.

[18] 胡春，劉左軍，李富香，等.鈍裂銀蓮花花粉活力測定方法的研究[J].植物研究，2013，33（5）：582-586.