彭燕+楊小青+張翔+戴諄+宋金春

[摘要] 目的 探討蓮子心總生物堿毒性及對四氯化碳急性肝損傷的保護作用。 方法 一次性給予給藥組昆明小鼠（10只）口服灌胃量2000 mg/kg蓮子心總堿，對照組昆明小鼠（10只）給予同等劑量0.3%羧甲基纖維素鈉，密切觀察72 h內(nèi)兩組小鼠的表現(xiàn)中毒癥狀以評價其急性毒性。SD大鼠隨機分為6組，分別作為空白對照組，模型組，陽性對照組（水飛薊素200 mg/kg），蓮子心總生物堿低、中、高劑量（100、200、400 mg/kg）組，以四氯化碳為誘導劑進行肝損傷誘導，造模24 h后再禁食16 h，檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，肝組織勻漿液中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）活性，同時測定肝臟系數(shù)，并觀察肝臟組織病理切片。 結(jié)果 對于昆明小鼠蓮子心總生物堿安全劑量可高達2000 mg/（kg·d）。100、200、400 mg/kg蓮子心總生物堿可改善模型組大鼠肝臟系數(shù)，逆轉(zhuǎn)受損大鼠血清中ALT、AST、ALP以及TBIL水平（P < 0.05），恢復受損肝組織中氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的含量，降低MDA水平（P < 0.05），各指標變換趨勢與劑量呈相關性。 結(jié)論 蓮子心總生物堿具有較高的安全性以及對急性肝損傷具有保護作用。

[關鍵詞] 蓮子心；總生物堿；抗氧化；急性肝損傷

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0025-05

Toxicity of Lotus plumule and its hepatoprotective for carbon tetrachloride leading acute hepatic damage

PENG Yan YANG Xiaoqing ZHANG Xiang DAI Zhun SONG Jinchun

Department of Pharmacy， Renming Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To discuss toxicity of Lotus plumule and its hepatoprotective for carbon tetrachloride leading acute hepatic damage. Methods Kunming mice （n=10） in drug group received 2000 mg/kg TALP， while Kunming mice in control group （n=10） received 0.3% sodium carboxymethyl cellulose at the same dose， then poisoning symptoms of mice were closely observed in 72 h and acute toxicity was evaluated. SD rats were randomly divided into 6 groups： blank control group， model group， positive control group （silymarin 200 mg/kg）， Lotus root total alkaloids low， medium and high dose group （100， 200， 400 mg/kg）， carbon tetrachloride induced acute liver injury， after molding 24 h and fasted for 16 h， the levels of serum alanine aminotransferase （ALT）， alkaline phosphatase （ALP）， total bilirubin （TBIL） and aspartate aminotrans ferase （AST） in serum，and the content of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione over activity of peroxidase （GSH-PX） and the content of malondialdehyde （MDA） were determined， the liver organ coefficient was also measured and pathological sections of the liver were observed. Results For Kunming mice， Lotus total alkaloid safe dose was as high as 2000 mg/（kg·d）. Liver organs coefficient of rats could be improved with 100， 200 and 400 mg/kg Lotus total alkaloid. The ALT， AST， ALP and TBIL in serum of injured rats were reversed （P < 0.05）， the SOD， CAT， GSH-Px recovered， and MDA contents reduced （P < 0.05）， changes tendency of index was related with dosage. Conclusion Lotus total alkaloid has high safety and protective effect on acute liver injury.

[Key words] Lotus plumule； Total alkaloids； Antioxidation； Acute liver injury

肝損傷是由多因素多環(huán)節(jié)所造成的肝細胞代謝狀態(tài)、生理功能以及組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為肝組織壞死、脂肪花、纖維化等，嚴重者可發(fā)展為肝癌[1-3]。目前臨床上采用治療肝損傷的藥物以化學藥物為主，但化學藥物存在單一用藥效果不好，聯(lián)合用藥增加肝臟代謝負荷的矛盾[4-5]，使其應用受限。因此，從天然產(chǎn)物中提取有效成分，挖掘治療肝損傷的新藥物已成為目前研究保護肝損傷藥物的熱點之一。

蓮子心（Lotus plumule）為睡蓮科蓮成熟種仁中的綠色胚芽，其主要成分之一為總生物堿（total alkaloids extracted from lotus plumule，TALP）。研究表明TALP具有廣泛的藥理學活性：如降壓，抑菌，降血脂、抑制肥胖，抗血栓作用，抗心律失常效應等[6-10]。同時，已有研究者指出甲基蓮心堿可逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對阿霉素的耐受性[11]。但目前關于TALP的體內(nèi)肝保護研究較少。因此，本研究采用大鼠模型，研究TALP對體內(nèi)肝損傷是否具有保護作用，以期為找出適宜的肝保護制劑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

蓮子心總生物堿（TALP），本實驗室自制，HPLC檢測含量甲基蓮心堿（76.88±2.31）%，蓮心堿含量為（8.37±1.21）%，異蓮心堿含量為（11.24±1.45）%，0.5%二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；四氯化碳，天津市永大化學試劑開發(fā)中心。水飛薊素對照品（批號：100281-200903，中國藥品生物制品檢定所），余下試劑均為分析純級別（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 實驗儀器

Bayer ADVIA2400全自動生化分析儀（德國西門子），倒置熒光顯微鏡（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）；成像系統(tǒng)（Nikon DS-U3，日本尼康）。其他一些常規(guī)實驗儀器設備。

1.3 實驗動物

健康昆明（KM）小鼠（18±2）g，20只，雌雄各半。Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（200±20）g，60只。均從武漢大學動物實驗中心購買（合格證：00003839、SCXK （鄂）2014-0013）。

1.4 方法

1.4.1 小鼠急性毒性試驗

KM小鼠根據(jù)性別以及重量自然分組分為對照組與給藥組，10只/組。給藥組一次性灌胃給予TALP最大劑量為2000 mg/kg，對照組以同樣容積0.3% CMC-Na灌胃給藥，給藥后小鼠，72 h內(nèi)密切觀察自由正常飲食KM小鼠死亡率、日常行為、精力狀況以及飲食情況。

1.4.2 大鼠急性肝損傷試驗

適應環(huán)境后，將SD大鼠隨機分為6組，10只/組，分別為空白組、模型組、陽性對照組，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組。其中，空白組、模型組大鼠口服灌胃給予0.3% CMC-Na劑量為1 mL/kg，大鼠口服灌胃給予200 mg/kg水飛薊素（0.3% CMC-Na溶解）；蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予100、200、400 mg/kg TALP（0.3% CMC-Na溶解），6組大鼠分別持續(xù)灌胃11 d，1次/d。第11天，繼各組大鼠灌胃給藥1 h后，模型組、陽性對照組、蓮子心總生物堿低、中、高劑量組分別腹腔注射50%橄欖油-四氯化碳溶液（注射劑量為2 mL/kg），同時，空白組大鼠腹腔注射同等劑量橄欖油（2 mL/kg）。試驗期間，每天記錄大鼠體重，密切觀察大鼠飲食量。繼腹腔注射50%四氯化碳 24 h后，將所有實驗大鼠禁食16 h后，心臟采血，血樣于3500 r/min，4℃，離心15 min，取上清液用于生化指標的檢測。分離全部肝臟，制成10%勻漿液，并于4000 r/min，4℃，離心10 min，取上清作為肝臟勻漿液于-20℃冰箱中保存待用。

1.4.3 檢測指標及方法

1.4.3.1 臟器系數(shù)測定 待肝臟于紗布上濾干后，迅速采用分析天平稱重，計算肝臟的臟器系數(shù)。臟器系數(shù)（%）=臟器體重（g）/大鼠體重（g）×100%。

1.4.3.2 血清生化指標檢測 檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）4個指標。

1.4.3.3 肝組織勻漿液中氧化指標檢測 分別按照試劑盒說明方法測定肝臟勻漿液中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA活性。

1.4.3.4 肝臟組織病理切片觀察 取一小塊，采用4%多聚甲醛固定肝臟，送檢測部門制作病理切片，蘇木精-伊紅染色（HE染色），于光學顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性試驗

給藥組小鼠均未表現(xiàn)出中毒死亡跡象。與對照組相比，給藥組小鼠72 h內(nèi)精神狀態(tài)明顯下降，日?；顒恿匡@著減少，表現(xiàn)為嗜睡、閉眼、食欲減少、弓背。72 h后觀察，給藥組小鼠逐步恢復正常生活，飲食正常，活動量增加，可推斷72 h后蓮子心總生物堿對小鼠正常生活無影響。

2.2 四氯化碳致大鼠急性肝損傷

2.2.1 臟器系數(shù)

TALP對大鼠肝臟系數(shù)的影響結(jié)果詳見表1。與空白組大鼠比較，模型組，陽性對照組，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠，肝臟器系數(shù)均顯著性增加（P < 0.05）。與模型組組大鼠比較，空白組以及陽性對照組，蓮子心總生物堿中、高劑量組大鼠肝臟系數(shù)顯著性下降（P < 0.05）。

2.2.2 蓮子心總生物堿對大鼠血清生化指標影響

與空白組組大鼠比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL含量均明顯地上升（P < 0.05）；與模型組大鼠比較，陽性對照組以及蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL含量均明顯下降（P < 0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；口服中、高劑量蓮子心總生物堿大鼠血清中AST、ALP、TBIL水平與空白組大鼠比較，三項指標差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；陽性對照組以及低劑量蓮子心總生物堿大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平均顯著性高于空白組大鼠（P < 0.05）。見圖1。

與空白組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P< 0.05；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP：堿性磷酸酶；TBIL：總膽紅素；GroupⅠ：空白組；GroupⅡ：模型組；GroupⅢ：陽性對照組；GroupⅣ：蓮子心總生物堿低劑量組；GroupⅤ：蓮子心總生物堿中劑量組；GroupⅥ：蓮子心總生物堿高劑組

圖1 蓮子心總生物堿對大鼠血清生化指標影響

2.2.3 蓮子心總生物堿對大鼠肝組織勻漿液中氧化指標的影響

與空白組大鼠比較，模型組大鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px含量均顯著性降低（P < 0.05），而MDA含量顯著性升高（P < 0.05）。與模型組大鼠比較，經(jīng)給藥后，陽性對照組，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA水平均出現(xiàn)顯著性逆轉(zhuǎn)情況（P < 0.05）。與空白組大鼠比較，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px含量均升高、MDA含量降低（P < 0.05）；蓮子心總生物堿低、中、高劑量組比較，肝組織中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA水平變化均表現(xiàn)出顯著性的劑量依賴性（P < 0.05）。

與空白組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；GroupⅠ：空白組；GroupⅡ：模型組；GroupⅢ：陽性對照組；GroupⅣ：蓮子心總生物堿低劑量組；GroupⅤ：蓮子心總生物堿中劑量組；GroupⅥ：蓮子心總生物堿高劑組；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化酶；MDA：丙二醛

2.2.4 蓮子心總生物堿對大鼠肝臟組織形態(tài)學的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織發(fā)生顯著性病變，口服灌胃給予水飛薊素、蓮子心總生物堿大鼠肝臟組織形態(tài)與模型組比較，均出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。且隨總生物堿劑量增大，細胞核邊緣可見，細胞間隙也更加清晰。見圖3。

3 討論

3.1 TALP對小鼠急性毒性作用研究

本研究采用最大量法研究72 h內(nèi)TALP對KM小鼠的影響。一次性給藥后72 h內(nèi)給藥組小鼠尤其在服藥2 h內(nèi)活動量顯著減少，推測其可能原因在于過多劑量的藥物對小鼠消化產(chǎn)生一定負擔，而且蓮子心總生物堿味苦，在服藥初期會對小鼠精神以及生理活動造成一定影響。72 h后，給藥組小鼠活動與對照組小鼠一致，說明TALP對小鼠無毒性作用，口服安全劑量可高達2000 mg/（kg·d），為TALP的后期應用提供安全性評價數(shù)據(jù)。

3.2 TALP對四氯化碳致肝損傷的保護作用

四氯化碳用于大鼠急性肝損傷造模是現(xiàn)在應用較為廣泛的一種模式去探討肝臟受損的原理以及篩選安全有效的治療藥物。研究報道四氯化碳致肝毒性是由于肝毒性代謝物以及自由基引起，其機理與誘發(fā)人多種肝損傷機制類似。本研究采用50% 四氯化碳（橄欖油溶解，V/V）一次性腹腔注射具有操作簡單，周期短，無實驗動物死亡的優(yōu)點[12-13]。

根據(jù)TALP對受損大鼠肝臟系數(shù)的影響結(jié)果，結(jié)果表明TALP與水飛薊素具有減輕肝組織肥大、降低臟器系數(shù)的作用。ALT、AST、ALP以及TBIL水平是臨床上常用于評價急性肝臟疾病的生化指標。模型組大鼠血清中上述4項指標[14-17]與空白組相比，顯著性升高（P < 0.05），提示肝細胞受到損害，細胞膜通透性增加，結(jié)合圖3可證實亦示本研究中四氯化碳致急性肝損傷模型成功。與模型組大鼠相比，給予山飛薊素和蓮子心總生物堿的大鼠血清中上述4指標均顯著降低（P < 0.05），說明TALP對生化指標的影響具有與水飛薊素相似的趨勢，可初步證實亦示TALP具有保護肝臟的作用。TALP對受損大鼠體內(nèi)上述四種酶變化的逆轉(zhuǎn)效應，提示總生物堿可通過提高SOD、CAT、GSH-Px水平，同時降低MDA活性，清除自由基，抑制肝細胞脂質(zhì)過氧化，以降低肝細胞的損傷程度。

臨床上常通過病理切片觀察肝組織形態(tài)學變化來直觀判斷肝組織損傷情況[18]。根據(jù)圖3A、B對比可發(fā)現(xiàn)本研究采用腹腔注射50%四氯化碳造模成功致大鼠產(chǎn)生急性脂肪肝。通過對比圖3C、D、E、F，發(fā)現(xiàn)給藥后，肝組織中脂肪病變部位明顯得到改善，TALP與水飛薊素具有相同的護肝作用。說明TALP具有抑制組織過氧化的作用，此結(jié)論與前期所做的工作測定氧化酶活性變化一致[19-20]。

本研究首次將TALP作用于急性肝損傷大鼠模型中，以考察TALP體內(nèi)肝保護作用。結(jié)果表明，TALP具有廣泛的安全性，安全劑量可高達2000 mg/（kg·d）。同時，100、200、400 mg/kg TALP可通過恢復受損肝組織中氧化酶的活性，清除自由基，抑制肝細胞脂質(zhì)過氧化達到有保護肝臟的作用，且400 mg/kg TALP對急性肝損傷的大鼠修復作用最強，為后期進一步作為護肝藥物的遴選提供理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 毛穎婕，徐彭，劉清華，等.肝損傷的中藥治療研究進展[J].江西中醫(yī)學院學報，2011，23（1）：91-94.

[2] 馬榮兵，藍紹穎.非酒精性脂肪肝危險因素的流行病學研究進展[J].實用醫(yī)學雜志，2010，23 （18）：3452-3454.

[3] 黃婷婷.非酒精性脂肪肝治療進展[D].安徽：蚌埠醫(yī)學院，2014：10-20.

[4] 師照敏.藥物性肝損傷治療體會[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2010，4（10）：154.

[5] Dongiovanni P，Lanti C，Riso P，et al. Nutritional therapy for nonalcoholic fatty liver disease [J]. The Journal of Nutritional Biochemistry，2016，29（1）：1-11.

[6] 陸曙，潘揚，陶冉，等.蓮心堿與蓮心季銨堿對腎性高血壓大鼠左室肥厚逆轉(zhuǎn)作用的比較[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2008，24（5）：327-329.

[7] Boustie J，Stigliani J L，Montanha J，et al. Antipoliovirus structure-activity relationships of some aporphine alkaloids [J]. J Nat Prod，1998，61（4）：480-484.

[8] 周雅君.甲基蓮心堿抗血小板活性及抗血栓作用的研究[D].武漢：華中科技大學，2013：11-21.

[9] 杜延榮，李方，王蒨，等.鹽酸去甲烏藥堿注射液負荷核素心肌灌注顯像診斷冠心病的有效性與安全性：Ⅱ臨床試驗[J].中華核醫(yī)學與分子影像雜志，2014，34（1）：34-38.

[10] 周素娟，杜貴友.去甲烏藥堿對心血管系統(tǒng)的影響[J].中國中藥雜志，2003，28（10）：910- 913.

[11] 艾小紅，唐小卿，劉艷萍，等.甲基蓮心堿逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/thermotolerance細胞對阿霉素耐受性的作用[J].癌癥，2007，26（4）：357-360.