胡羅松，鄭青松，文雨欣，王和德，楊雄志，翟永貞，張霞，3，李冰，3*

（1.廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司，廣東 廣州 511442；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

從自然資源中分離提取出來(lái)的天然生物活性多糖因具有抗氧化[1]、抗炎[2]、降血糖[3]、提高機(jī)體免疫力[4]、抗菌[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、調(diào)節(jié)腸道菌群[8]等生物活性而被人們廣泛關(guān)注，在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

蓮子心（Plumula nelumbinis）為睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的成熟種子中間的綠色幼葉及胚根[9]?！吨袊?guó)藥典》收錄記載：蓮子心具有清心火、平肝火、清心安神等作用。蓮子心多糖是蓮子心中的主要化學(xué)成分之一[10]，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于蓮子心多糖的研究較少。目前關(guān)于蓮子心多糖的提取方法主要局限于熱水浸提法[11-12]，新型提取方法（如超聲輔助提取、酶輔助提取和微波輔助提取等）應(yīng)用較少。其中微波輔助提取法（microwave-assisted extraction，MAE）是一種短時(shí)間內(nèi)高效提取蓮子心多糖的新型輔助提取方法[13]。多糖提取過(guò)程中常常伴隨著色素類雜質(zhì)。大孔樹(shù)脂法常被用來(lái)去除多糖提取物中色素類雜質(zhì)[14]。本文首先利用響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)微波輔助提取蓮子心多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，然后利用大孔樹(shù)脂AB-8進(jìn)行蓮子心多糖的脫色處理，最后對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，建立一種高效提取蓮子心多糖的方法，得到一種具有較好抗氧化活性的蓮子心多糖，為開(kāi)發(fā)天然的抗氧化產(chǎn)品提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥蓮子心：湘潭蓮子生產(chǎn)基地。利用小型中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到蓮子心粉末備用；乙醇、苯酚、濃硫酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大孔樹(shù)脂AB-8：上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

高速中草藥粉碎機(jī)（XL-20B型）：廣州旭朗有限公司；微波萃取儀（Milestone Ethos）：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10 auto FLEX）：德國(guó)IKA公司；高速冷凍離心機(jī)（3-30KS）：美國(guó)Sigma公司；真空冷凍干燥機(jī)（Wizard2.0）：美國(guó)VirTis公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Carry 50 Conce）：美國(guó)Varian公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蓮子心多糖的提取

取粉碎后的蓮子心粉末，以蒸餾水為提取溶劑，利用微波萃取儀提取得到蓮子心多糖提取液，離心（6 000 r/min，5 min）、抽濾（0.45 μm 水系膜），除去微小固體雜質(zhì)。減壓真空濃縮后，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4℃條件下，放置 12 h，6 000 r/min離心 3 min，取沉淀，冷凍干燥得到蓮子心粗多糖。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 微波功率對(duì)蓮子心多糖得率的影響

精確稱取1 g蓮子心粉末，加入25 mL去離子水[液料比 25 ∶1（mL/g）]，分別在 300、400、500、600、700、800 W的功率下，微波輔助提取4 min，考察微波功率對(duì)蓮子心多糖得率的影響。

1.2.2.2 液料比對(duì)蓮子心多糖得率的影響

精確稱取 1g蓮子心粉末，分別加入 10、15、20、25、30mL 去離子水 [液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30 ∶1（mL/g）]，在 600 W 下，微波輔助提取 4 min，考察液料比對(duì)蓮子心多糖得率的影響。

1.2.2.3 微波時(shí)間對(duì)蓮子心多糖得率的影響

精確稱取1 g蓮子心粉末，加入25 mL去離子水[液料比 25 ∶1（mL/g）]，在 600 W 下，分別微波輔助提取 1、2、3、4、5、6 min，考察微波時(shí)間對(duì)蓮子心多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇適合的因素水平，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Box-Behnken experiment design factors and level

1.2.4 大孔樹(shù)脂脫色試驗(yàn)

參考張玉等[14]的方法，利用AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)蓮子心多糖進(jìn)行脫色處理。取蓮子心多糖粉末，用蒸餾水配制成1 mg/mL蓮子心多糖溶液。設(shè)定脫色溫度40℃、脫色時(shí)間60 min、大孔樹(shù)脂添加量4 g，采用單因素試驗(yàn)考察大孔樹(shù)脂添加量（2、3、4、5、6 g/20 mL）、脫色時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、脫色溫度（30、40、50、60、70℃）對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響。

1.2.5 多糖得率測(cè)定

利用苯酚-硫酸法對(duì)多糖含量進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取1.000 g于105℃充分干燥的葡萄糖，溶于1 000 mL蒸餾水，制成1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。繼續(xù)取1.0 mL葡萄糖儲(chǔ)備液稀釋至100 mL，得到100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取 100 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，分別置于試管中，加蒸餾水至2 mL。加入現(xiàn)配的6%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加入95%濃硫酸5 mL，充分振蕩后于40℃保溫20 min，冷卻至25℃，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[Y=0.025 5X-0.190 7（R2=0.998 8）]，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品多糖得率與純度，計(jì)算公式如下。

式中：M0為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品中多糖質(zhì)量，g；M1為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Ma等[15]的方法并稍作修改。取脫色后的蓮子心多糖，溶于蒸餾水，配制0.2 mg/mL～2.0 mg/mL的多糖溶液，用乙醇配制60 μmol/L DPPH溶液，各取150 μL多糖樣品和DPPH溶液，加到96孔板，混合均勻后，暗處反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，乙醇代替DPPH作本底對(duì)照，抗壞血酸（VC）作陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：A1為樣品吸光度；A2為本底對(duì)照吸光度；A0為空白對(duì)照吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

參考Chen等[16]的方法，配制7 mmol/LABTS溶液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，將二者等體積混合，置于暗處反應(yīng)12 h。然后用無(wú)水乙醇稀釋，直至混合溶液在734 nm處吸光度在0.70±0.05，得到ABTS工作液。取20 μL脫色后蓮子心多糖溶液（0.2 mg/mL～2.0 mg/mL）與180 μL ABTS工作液混合，25℃振動(dòng)孵化5 min，734 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，乙醇代替ABTS作本底對(duì)照，VC作陽(yáng)性對(duì)照。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：B1為樣品吸光度；B2為本底對(duì)照吸光度；B0為空白對(duì)照吸光度。

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

參考Liang等[17]的方法，配制0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2），6 mmol/L的鄰苯三酚溶液。取30 μL脫色后的蓮子心多糖溶液（0.2 mg/mL～2.0 mg/mL），加入150 μL緩沖溶液，25℃反應(yīng)10 min，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。之后加入30 μL配制好的鄰苯三酚溶液，325 nm處測(cè)定吸光度（30 s測(cè)定一次，持續(xù)5 min）。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：C0為鄰苯三酚自氧化后的吸光度；C1為加入樣品后的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并使用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對(duì)蓮子心多糖得率的影響

設(shè)定液料比為 25∶1（mL/g）、微波時(shí)間為 4 min，在300 W～800 W內(nèi)，考察微波功率對(duì)蓮子心多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The influence of microwave power on the yield of polysaccharide

如圖1所示，隨著微波功率的增加，蓮子心多糖得率逐漸上升，到600 W時(shí)得率最高，之后繼續(xù)增加微波功率，蓮子心多糖得率變化趨勢(shì)平穩(wěn)。提高微波功率，有利于促進(jìn)多糖的滲出及擴(kuò)散，但是微波功率達(dá)到一定時(shí)，多糖的滲出與擴(kuò)散達(dá)到平衡，這時(shí)即使繼續(xù)增加微波功率也難以促進(jìn)多糖的提取。所以，微波輔助提取蓮子心多糖的功率選擇600 W較為適宜。

2.1.2 液料比對(duì)蓮子心多糖得率的影響

設(shè)定微波功率為600 W、微波時(shí)間為4 min、在液料比 10∶1（mL/g）～30 ∶1（mL/g）內(nèi)，考察液料比對(duì)蓮子心多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 The influence of liquid-to-material ratio on the yield of polysaccharide

如圖2所示，隨著溶劑體積不斷增大，蓮子心多糖得率呈逐步上升的趨勢(shì)，在液料比大于25∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率的變化趨勢(shì)趨于平緩。溶劑體積增加，有利于增加多糖濃度差，可促進(jìn)多糖的擴(kuò)散。但是，當(dāng)多糖的擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，再增加溶劑體積作用也不大，反而會(huì)增加后續(xù)濃縮工藝的壓力。因此，蓮子心多糖的液料比選擇25∶1（mL/g）較合適。

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)蓮子心多糖得率的影響

設(shè)定微波功率為600 W、液料比為25∶1（mL/g）、在微波時(shí)間1 min～6 min內(nèi)考察微波時(shí)間對(duì)蓮子心多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The influence of microwave time on the yield of polysaccharide

如圖3所示，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，蓮子心多糖得率上升趨勢(shì)明顯，在4 min時(shí)達(dá)到最大值，在4 min～6 min多糖得率基本不變。因此，考慮減少能量損耗和高效提取的目的，提取蓮子心多糖的微波時(shí)間在4 min左右較為合適。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，表2為試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

通過(guò)多項(xiàng)式回歸分析得到一個(gè)二次多項(xiàng)式，可用來(lái)預(yù)測(cè)微波輔助提取蓮子心多糖的得率，回歸方程為Y=4.77+0.23X1+0.14X2+0.22X3-0.044X1X2+0.053X1X3-0.009 5X2X3-0.29X12-0.17X22-0.32X32。

方差分析和多元回歸分析如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance table for regression model

續(xù)表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Analysis of variance table for regression model

由表3可知，模型的F值為30.44，p值小于0.001，說(shuō)明模型建立具有顯著性，并且模型的失擬項(xiàng)p＞0.05，不顯著，說(shuō)明可以通過(guò)該模型來(lái)預(yù)測(cè)微波輔助提取蓮子心多糖的最優(yōu)提取條件。在回歸模型中，X1、X3、X12、X32對(duì)蓮子心多糖得率的影響高度顯著，X2、X22對(duì)蓮子心多糖得率影響極顯著，而X1X2、X1X3、X2X3影響不顯著，說(shuō)明3種因素本身均對(duì)蓮子心多糖得率有較大影響，但3種因素間的交互作用并不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面和等高線圖見(jiàn)圖4。

圖4 微波功率、液料比和微波時(shí)間對(duì)蓮子心多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surfaces plots and contour plots showing the effects of microwave power，liquid-solid ration，extraction time，on the Plumula nelumbinis polysaccharide yield

由圖4可知，液料比和微波時(shí)間均對(duì)得率有較大影響，在28∶1（mL/g）和4.5 min附近時(shí)有最大得率，等高線圖呈現(xiàn)不明顯的橢圓狀，結(jié)合方差分析結(jié)果，二者之間相互作用并不顯著。在微波功率為680 W、微波時(shí)間為4.5 min時(shí)有最大得率，等高線圖為圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果可知微波功率和微波時(shí)間相互作用不顯著。在液料比28∶1（mL/g），微波功率680 W時(shí)有最大的多糖得率，但二者的等高線圖呈圓形，說(shuō)明料液比和微波功率相互作用不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

模型中最優(yōu)工藝條件為微波時(shí)間4.517 min、微波功率 680.73 W、液料比 28.48∶1（mL/g），在此條件下多糖得率為4.81%。考慮實(shí)際操作情況，將此工藝條件修正為微波時(shí)間4.5 min、微波功率680 W、液料比28∶1（mL/g），修正后的多糖得率為（4.84±0.11）%，與預(yù)測(cè)值4.81%的相對(duì)誤差為0.62%，驗(yàn)證結(jié)果表明模型建立成功，并且此提取工藝合理可靠。

2.3 大孔樹(shù)脂脫色試驗(yàn)

2.3.1 大孔樹(shù)脂添加量對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響

大孔樹(shù)脂添加量對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 大孔樹(shù)脂添加量對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響Fig.5 The effect of macroporous resin addition on the decolorization rate and retention rate of Plumula nelumbinis polysaccharide yield

如圖5所示，隨著大孔樹(shù)脂添加量的增加，吸附色素能力增強(qiáng)，蓮子心多糖的脫色率逐漸增加，但同時(shí)多糖的保留率逐漸降低。因此，綜合考慮多糖脫色率和保留率，選取大孔樹(shù)脂添加量為4 g。

2.3.2 脫色時(shí)間對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響

設(shè)定脫色溫度為40℃、大孔樹(shù)脂添加量為4 g，在脫色時(shí)間20 min～100 min內(nèi)，考察脫色時(shí)間對(duì)脫色率和多糖保留率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 脫色時(shí)間對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響Fig.6 The effect of decolorization time on the decolorization rate and retention rate of Plumula nelumbinis polysaccharide yield

如圖6所示，蓮子心多糖的脫色率隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，同時(shí)多糖保留率也隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，因此，為保證蓮子心多糖一定的脫色率和保留率，選定脫色時(shí)間為60 min。

2.3.3 脫色溫度對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響

設(shè)定脫色時(shí)間為60 min、大孔樹(shù)脂添加量為4 g，在脫色溫度30℃～70℃內(nèi)，考察脫色溫度對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 脫色溫度對(duì)蓮子心多糖脫色率和保留率的影響Fig.7 The effect of decolorization temperature on the decolorization rate and retention rate of Plumula nelumbinis polysaccharide yield

如圖7所示，隨著脫色溫度的升高，蓮子心多糖的脫色率平緩上升，同時(shí)多糖保留率也隨著溫度的升高逐漸降低。因此，為保證蓮子心多糖一定的脫色率和保留率，脫色溫度選取50℃。

經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)后，確定適宜的蓮子心多糖大孔樹(shù)脂AB-8脫色工藝條件為20 mL，1 mg/mL的蓮子心多糖大孔樹(shù)脂添加量4 g、脫色時(shí)間60 min和脫色溫度50℃。脫色率達(dá)到（65.12±0.88）%，多糖損失率為（30.33±0.58）%。

2.4 蓮子心多糖的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力

蓮子心多糖的DPPH自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 蓮子心多糖的DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH radical scavenging ability of Plumula nelumbinis polysaccharide

如圖8所示，在0.2 mg/mL～2.0 mg/mL內(nèi)，隨著濃度的增加，蓮子心多糖清除DPPH自由基的能力不斷增大。在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，蓮子心多糖的DPPH自由基清除率達(dá)到最大值（86.01±1.63）%，可見(jiàn)，蓮子心多糖具有良好的DPPH自由基清除能力。此結(jié)果高于Khan等[18]從Porphyra haitanensis提取的多糖濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率（34.63%）。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力

蓮子心多糖的ABTS+自由基清除能力見(jiàn)圖9。

圖9 蓮子心多糖的ABTS+自由基清除率Fig.9 ABTS+radical scavenging ability of Plumula nelumbinis polysaccharide

如圖9所示，在0.2 mg/mL～2.0 mg/mL內(nèi)，蓮子心多糖表現(xiàn)出良好的ABTS+自由基清除能力，并隨著樣品濃度的增加呈上升趨勢(shì)。蓮子心多糖的IC50值為0.23 mg/mL，在樣品濃度為2.0 mg/mL時(shí)，蓮子心多糖的 ABTS+清除率達(dá)到（88.67±0.47）%，高于部分其他來(lái)源的多糖，如Gu等[19]從Sagittaria sagittifolia L.中提取的多糖（濃度為5.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基清除率為91.19%）。

2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

蓮子心多糖的超氧陰離子自由基清除能力見(jiàn)圖10。

圖10 蓮子心多糖的超氧陰離子自由基清除能力Fig.10 Superoxide radical scavenging ability of Plumula nelumbinis polysaccharide

如圖10所示，在0.2 mg/mL～2.0 mg/mL內(nèi)，隨著濃度的增大蓮子心多糖的超氧陰離子自由基清除率升高，其IC50值為0.28 mg/mL。在樣品濃度為2.0 mg/mL時(shí)，蓮子心多糖的超氧陰離子自由基清除率達(dá)到最高值為（75.92±1.51）%。以上結(jié)果說(shuō)明蓮子心多糖的具有較好的超氧陰離子自由基清除能力，并且清除能力高于Chen等[20]從Bletilla striata須根中提取得到的多糖（濃度為5.0 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基清除率為72.27%）。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后，微波輔助提取蓮子心多糖的最佳工藝為微波時(shí)間4.5 min、微波功率680 W、液料比28∶1（mL/g），此時(shí)的多糖得率為（4.84±0.11）%。單因素優(yōu)化后的大孔樹(shù)脂脫色工藝為大孔樹(shù)脂添加量4 g、脫色時(shí)間60 min、脫色溫度50℃。所得蓮子心多糖對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基和超氧陰離子自由基清除率的IC50值分別為0.28、0.23 mg/mL和0.28 mg/mL。在樣品濃度為2.0 mg/mL時(shí)，蓮子心多糖的DPPH自由基清除率達(dá)（86.01±1.63）%，ABTS+自由基清除率達(dá)（88.67±0.47）%，超氧陰離子自由基清除率達(dá)（75.92±1.51）%，說(shuō)明蓮子心多糖具有良好的DPPH自由基、ABTS+自由基和超氧陰離子自由基清除能力。本研究結(jié)果提供了一種高效提取蓮子心多糖的方法并為蓮子心多糖作為功能性原料用于食品提供了理論數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。