張?zhí)N琦+徐鳳花++張書(shū)敏++吳優(yōu)++張晴

摘要：將崩解濾紙能力強(qiáng)的菌系1在30 ℃條件下以水稻秸稈為唯一碳源連續(xù)馴化41代，25代后羧甲基纖維素鈉（CMC）酶活力、濾紙酶活力和秸稈失重率基本穩(wěn)定，較第1代提高了59.7%、61.0%和62.4%。利用PCR-DGGE對(duì)馴化進(jìn)程中菌系1細(xì)菌組成多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群的變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析，原始樣品共檢測(cè)到13個(gè)主要條帶，優(yōu)勢(shì)菌群由Solitalea sp.、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和一些不可培養(yǎng)微生物組成。經(jīng)濾紙及水稻秸稈?cǎi)Z化，部分細(xì)菌被淘汰，微生物多樣性減少，濾紙和水稻秸稈?cǎi)Z化穩(wěn)定期優(yōu)勢(shì)菌群均包括多形擬桿菌屬（Bacteroides sp.）、梭菌屬（Clostridium sp.）和假單胞菌屬，表明這些優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)濾紙纖維素和水稻秸稈纖維素均有較強(qiáng)的降解能力，此外，條帶10（Uncultured Clostridium sp. Clone 3-2）在水稻秸稈?cǎi)Z化33代顏色變深成為優(yōu)勢(shì)菌，推測(cè)在水稻秸稈降解過(guò)程中具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：菌系1；馴化；水稻秸稈；變性梯度凝膠電泳；多樣性；優(yōu)勢(shì)菌群

中圖分類(lèi)號(hào)： X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0257-04

2013年黑龍江省水稻秸稈量為2 400萬(wàn)t，約占秸稈總量的39.3%[1]。由于水稻秸稈木質(zhì)素縮聚單元比例較高，與纖維素和半纖維素結(jié)合較緊密，硅質(zhì)化程度高[2]，同時(shí)黑龍江年均氣溫較低，因此其自然降解速度緩慢，資源化利用率低，大量焚燒嚴(yán)重污染環(huán)境。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者選育出一些能夠降解水稻秸稈的菌株，主要包括木霉菌、青霉菌和一些細(xì)菌，但是，研究發(fā)現(xiàn)單菌株產(chǎn)酶能力有限[3]，且水稻秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難被高效降解，而菌系通過(guò)多種微生物協(xié)同作用對(duì)水稻秸稈降解效果更好，然而，目前對(duì)菌系的研究較少。本試驗(yàn)在30 ℃下以6種不同來(lái)源的樣品為菌源，采用限制性篩選的方法，利用水稻秸稈定向馴化培養(yǎng)，獲得能夠高效穩(wěn)定降解水稻秸稈的菌系，并通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)揭示該菌系細(xì)菌組成多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群的變化動(dòng)態(tài)。

1材料與方法

1.1樣品來(lái)源（表1）

1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)液[4]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，微量元素液0.5 mL，土壤浸汁100 mL，蒸餾水900 mL，121 ℃滅菌30 min。

微量元素溶液成分：ZnSO4 0.29 g，CaCl2 0.24 g，CuSO4 025 g，MgSO4 0.17 g。

土壤浸汁：土壤與去離子水以質(zhì)量比1 ∶1，攪拌混合，過(guò)濾，滅菌后備用。

蛋白胨纖維素培養(yǎng)液（PCS）[5]：蛋白胨5.0 g，纖維素（新華濾紙/水稻秸稈）5.0 g，NaCl 5.0 g，CaCO3 2.0 g，酵母粉 1.0 g，蒸餾水1.0 L，121 ℃滅菌30 min。1.3試劑

EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸鈉）、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、磷酸二氫鈉、異丙醇、蛋白酶K、磷酸氫二鈉、異戊醇、溶菌酶、Tris-飽和酚、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、冰乙酸、過(guò)硫酸銨、DNA膠回收試劑盒，試劑均為分析純。

DNA提取液的配制[6]：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.1 mol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB，pH值為8.0。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1樣品富集稱(chēng)取1～6號(hào)樣品各10 g，分別加入 150 mL 富集培養(yǎng)液中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，富集3代，10 d/代，傳代接種量為15%。

1.4.2菌系初篩采用濾紙條崩解法，向150 mL蛋白胨纖維素培養(yǎng)基（濾紙）中接入20 mL富集培養(yǎng)液，30 ℃靜置培養(yǎng)，馴化5代，10 d/代，選擇濾紙崩解的樣品，繼續(xù)多代馴化。

1.4.3菌系復(fù)篩待菌系降解濾紙能力穩(wěn)定后，采用蛋白胨纖維素培養(yǎng)基（水稻秸稈）繼續(xù)定向馴化培養(yǎng)，第4天測(cè)定CMC酶活及濾紙酶活，第7天測(cè)定樣品中秸稈失重率。

1.4.4纖維素酶活性測(cè)定采用DNS法[7]測(cè)定CMC酶活性和濾紙酶活性。

1.4.5秸稈失重率測(cè)定將水稻秸稈發(fā)酵液離心，棄上清，加入鹽酸和硝酸混合液，過(guò)濾，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，將剩余物轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，于105 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量。按照公式計(jì)算失重率[8]。

失重率ω=[（m1-m2）/m0]×100%。

其中，m0為水稻秸稈初始質(zhì)量（g），m1為培養(yǎng)皿與樣品烘干恒質(zhì)量（g），m2為培養(yǎng)皿質(zhì)量（g）

1.4.6菌系DNA提取及PCR-DGGE分析

1.4.6.1菌系總DNA提取及純化取原始樣品以及濾紙和水稻秸稈?cǎi)Z化中期、穩(wěn)定期的發(fā)酵液為樣品，置于離心管（樣液為10 mL），-20 ℃凍存。按照呂新等報(bào)道的高鹽法[6]提取DNA，得DNA粗提液，取5 μL作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并選用OMEGA生物技術(shù)公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，純化DNA。

1.4.6.2菌系16S rDNA V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增用于DGGE電泳的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物引物序列為[9]338F （5′-CGCCCGCCG

CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGG

GAGGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）；反應(yīng)體系[10]：模板DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正反引物各0.5 μL，5 U/μL Taq聚合酶 0.25 μL，加雙蒸水至25 μL；PCR反應(yīng)條件[11]：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，65 ℃復(fù)性8 min，72 ℃延伸2 min，共40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.6.3變性梯度凝膠電泳采用Bio-Rad變性梯度凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑梯度為35%～65%，電泳緩沖液為1×TAE，上樣量為30 μL PCR產(chǎn)物和10 μL 6×溴酚藍(lán)二甲苯氰溶液，在60 ℃、60 V條件下電泳14 h。紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，并對(duì)DGGE圖譜上的優(yōu)勢(shì)條帶和差異條帶進(jìn)行割膠回收，將其放入滅菌的200 μL離心管中，加入20 μL滅菌的去離子水中，4 ℃放置過(guò)夜。取2 μL DNA浸出液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并再次進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，對(duì)單一條帶進(jìn)行切膠回收及PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送交華大基因公司測(cè)序。

2結(jié)果與分析

2.1菌系馴化

將不同來(lái)源的6個(gè)樣品在PCS培養(yǎng)基（濾紙）中馴化至第5代，僅1號(hào)和3號(hào)樣品濾紙條部分崩解，其他樣品濾紙無(wú)明顯崩解現(xiàn)象。對(duì)1號(hào)和3號(hào)樣品馴化至23代，第7天1號(hào)樣品濾紙均崩解為片狀，3號(hào)中濾紙斷裂；第10天1號(hào)濾紙完全降解，菌液呈淡黃色，3號(hào)濾紙崩解為片狀，表明隨著馴化代數(shù)的增加，樣品中菌系對(duì)濾紙崩解能力逐漸增強(qiáng)。

2.2菌系復(fù)篩

為得到能夠快速穩(wěn)定降解水稻秸稈的菌系，將菌系1和菌系3在以水稻秸稈為唯一碳源的PCS培養(yǎng)基中定向馴化培養(yǎng)，不同馴化代次CMC酶活性與濾紙酶活性如圖1所示。1～25代酶活性均逐漸提高，第25代菌系1 CMC酶活性與濾紙酶活性分別為59.4、29.3 U/mL，較第1代提高了59.7%、61.0%，菌系3為50.2、25.6 U/mL，較第1代提高了49.9%、56.1%，菌系1較菌系3高18.3%、14.5%，表明馴化培養(yǎng)對(duì)提高菌系1酶活性效果明顯，且菌系1酶活性強(qiáng)于菌系3。楊冰從長(zhǎng)期耕種的水稻田中篩選出水稻秸稈降解復(fù)合菌系 I-D，37℃條件下培養(yǎng)2 d，CMC酶活最高為 24.2 U/mL[12]。

由圖2可見(jiàn)，在各代次馴化培養(yǎng)第7天時(shí)，1～25代水稻秸稈失重率逐漸增加，第25代菌系1和菌系3秸稈失重率為39.3%、31.0%，較第1代提高62.4%、62.3%，菌系1較菌系3高26.8%，表明菌系1對(duì)水稻秸稈降解能力強(qiáng)于菌系3。劉甲峰等從免耕多年還田的土壤中馴化獲得1組纖維素降解菌系，第7天稻秸失重率為30.0%[13]。朱虹等從稻草堆底土壤篩選的纖維素降解菌系第7天稻秸失重率為39.6%[14]。

2.3DGGE監(jiān)測(cè)菌系1群落結(jié)構(gòu)

2.3.1菌系1總DNA提取由于菌系1降解能力強(qiáng)于菌系3，因此采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)菌系1優(yōu)勢(shì)菌群變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。總DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，各樣品基因片段大小均約為23 kb，5條主帶清晰較亮，表明DNA完整性較好，但各條帶存在拖尾現(xiàn)象，且點(diǎn)樣孔處均不同程度地發(fā)亮，說(shuō)明樣品中含有未除去的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。以純化后的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為200 bp左右，條帶清晰單一（圖4），可用于DGGE分析。

2.3.2菌系1菌群組成變化動(dòng)態(tài)DGGE圖譜中1個(gè)條帶可能代表1種微生物，同時(shí)顏色相對(duì)較深的條帶是優(yōu)勢(shì)菌，菌系1不同時(shí)期條帶的數(shù)目及顏色深淺存在差異，如圖5所示，在馴化過(guò)程中，微生物組成發(fā)生變化。原始樣品共檢測(cè)出13個(gè)主要條帶，說(shuō)明微生物多樣性較豐富，條帶2、4、5、6、7、11、12、13顏色較深，代表菌系的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。濾紙馴化過(guò)程中，條帶2、4、5、11、12、13顏色持續(xù)變淺，對(duì)濾紙降解能力較弱，馴化9代，與原始樣品相比，條帶1、8、9顏色變深，條帶3、10、11顏色深淺沒(méi)有明顯變化，第23代條帶3、6、7變深，條帶1、3、6、7、8、9代表的細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)菌，表明這些細(xì)菌逐漸適應(yīng)濾紙培養(yǎng)環(huán)境并趨于穩(wěn)定，對(duì)濾紙降解能力較強(qiáng)。

水稻秸稈?cǎi)Z化培養(yǎng)13代的樣品檢測(cè)出9個(gè)主要條帶，菌系微生物多樣性減少。與濾紙馴化23代相比，條帶2、4、5代表的細(xì)菌被淘汰，條帶1、10、11、12、13深淺無(wú)明顯變化，條帶3、6、7、8、9變淺，表明水稻秸稈?cǎi)Z化初期，菌系中微生物由于未能適應(yīng)碳源的變化，活性降低，當(dāng)培養(yǎng)33代時(shí)，條帶11消失，條帶1、3、6、7、8、9、10較深，代表的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，說(shuō)明這些條帶代表的細(xì)菌對(duì)水稻秸稈降解能力較強(qiáng)，共同組成一個(gè)能穩(wěn)定降解水稻秸稈的菌系。

DGGE圖譜條帶測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2，除條帶4、5、10、11、12、13與某些不可培養(yǎng)微生物相似外，其他各主要條帶的近緣菌分別歸屬于多形擬桿菌屬（Bacteroides sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、梭菌屬（Clostridium sp.）和Solitalea sp.。原始樣品優(yōu)勢(shì)菌群為Solitalea sp.、Pseudomonas sp.和一些不可培養(yǎng)微生物，經(jīng)濾紙馴化優(yōu)勢(shì)菌群變化較大，演替為Bacteroides sp.、Clostridium sp. 和Pseudomonas sp.，水稻秸稈?cǎi)Z化穩(wěn)定期優(yōu)勢(shì)菌群包括Bacteroides sp.、Clostridium sp.、Pseudomonas sp.和Uncultured Clostridium sp. Clone 3-2。

3討論

菌系1 DGGE圖譜中條帶1與多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482）同源率為97%，馴化各時(shí)期均為優(yōu)勢(shì)菌，多形擬桿菌是一種碳水化合物降解細(xì)菌，Kim等研究發(fā)現(xiàn)Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482含有1個(gè)編碼糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因，能夠降解纖維素等多糖物質(zhì)[15]。條帶3、6序列與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens Pf0-1）相似性達(dá)到99%，條帶7與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）相似性為100%，在不同時(shí)期樣品中均存在。目前已有研究顯示，熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌均具有纖維素降解能力，尹礎(chǔ)等分離出1株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的纖維素降解菌，其與熒光假單胞菌16S rDNA核苷酸同源率達(dá)到99%以上[16]。李平等將篩選的5株細(xì)菌構(gòu)建1組高效纖維素降解菌系，經(jīng)