王浩 張震中 李中春 趙冰

丹皮酚預(yù)處理抑制MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用研究

王浩 張震中 李中春 趙冰

目的 探討丹皮酚（Pae）預(yù)處理抑制1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用及機(jī)制。方法 以MPP+刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立帕金森病細(xì)胞模型，以不同濃度的Pae預(yù)處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，采用CCK-8、免疫細(xì)胞熒光法、ELISA分別檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性、吞噬活性和炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的釋放。結(jié)果 與對(duì)照組比較，MPP+0.1μmol/L可明顯誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性、吞噬活性的增強(qiáng)以及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放（均P＜0.01）。與MPP+組比較，MPP++Pae（5、25μmol/L）組預(yù)處理后MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性、吞噬活性明顯減弱，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 結(jié)論 MPP+可誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖、吞噬活性增強(qiáng)以及炎癥因子釋放；經(jīng)MPP++Pae（5、25μmol/L）預(yù)處理后，可抑制以上效應(yīng)，推測(cè)與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性及抗炎作用有關(guān)。

丹皮酚 帕金森病 小膠質(zhì)細(xì)胞 炎癥因子

帕金森?。╬arkinson disease，PD）是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，尤其在60歲以上人群中發(fā)病率達(dá)1%～2%，黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性和選擇性缺失是其主要病理特征[1]。目前PD確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床上缺乏控制病程進(jìn)展的有效治療措施，主要采取對(duì)癥治療；因此，深入探討PD發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療藥物十分迫切[2]。丹皮酚（Pae）是從毛莨科植物牡丹干燥根皮與蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿中提取的單體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用十分廣泛[3]。有研究表明Pae對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的PD小鼠具有保護(hù)作用[4]；本課題組既往研究表明Pae對(duì)魚(yú)藤酮、1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞免疫神經(jīng)的炎癥細(xì)胞，維持神經(jīng)元微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。由于小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷被公認(rèn)為是PD發(fā)病的重要機(jī)制[6]，因此，筆者以BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，探究Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清購(gòu)自中國(guó)杭州四季青生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MPP+購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；Pae注射液（10mg/2ml）購(gòu)自中國(guó)上海第一生化藥業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM培養(yǎng)液配置，無(wú)菌過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆茫恍∈驣L-1βELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)武漢博士德公司；熒光微球購(gòu)自美國(guó)Inventrogen公司；兔抗 Iba-1抗體購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Millipore公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BX51型倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；Elx800型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-TEK公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞凍于液氮中，實(shí)驗(yàn)時(shí)常規(guī)復(fù)蘇。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%滅活胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液復(fù)蘇，細(xì)胞匯集至80%時(shí)進(jìn)行傳代接種，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、MPP+組、MPP++Pae（1、5、25μmol/L）組，共5組。細(xì)胞接種于96孔板上，接種密度為1×105/ml；選擇細(xì)胞貼壁形態(tài)且生長(zhǎng)狀態(tài)良好者用于實(shí)驗(yàn)；培養(yǎng)24h后加入不同濃度的Pae，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h后；對(duì)照組加入培養(yǎng)基，其他4組分別加入含0.1μmol/LMPP+的DMEM培養(yǎng)基，維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性 取出培養(yǎng)板，每孔加入10μl CCK-8反應(yīng)液，在5%CO2孵箱中，37℃反應(yīng)10min后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處樣品吸光度值（OD450），用于計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.2.3 免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性 取出培養(yǎng)板，加入熒光微球（直徑1μm）作用1h。實(shí)驗(yàn)完畢當(dāng)天，0.01mol/L PBS沖洗5min×3次；非免疫羊血清封閉2h，吸干；加入一抗工作液（兔抗人Iba-1抗體，1∶1 000），置于4℃濕盒中孵育過(guò)夜。第2天用0.01mol/L PBS沖洗后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗（IgG，1∶200）室溫避光孵育2h，0.01mol/L PBS沖洗后甘油-碳酸鹽緩沖液（含DAPI）封片；熒光顯微鏡下掃描記錄并保存圖像，用于計(jì)算BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬指數(shù)（PI）。PI=吞噬熒光微球的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100.00%；吞噬指數(shù)越高，表明BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性越強(qiáng)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6釋放水平 收集上清液及細(xì)胞，低溫離心后上清液分裝至-40℃冰箱內(nèi)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)炎癥因子的釋放水平；同時(shí)，將收集的細(xì)胞經(jīng)蛋白裂解液裂解后，按Bradford法進(jìn)行蛋白定量分析，測(cè)定各蛋白提取液中的蛋白濃度，最后折算為每毫克總蛋白中IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以MPP+誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活建立PD細(xì)胞模型，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPP+0.1μmol/L作用24h可明顯誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活，引起細(xì)胞形態(tài)改變（細(xì)胞突起變短，胞體變大變圓）、細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MPP+0.1μmol/L作用24h可增強(qiáng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放；隨著MPP+濃度增大，會(huì)引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細(xì)胞活性及吞噬功能下降，炎癥因子釋放水平下調(diào)。因此，選擇該條件（MPP+0.1μmol/L作用24h）作為誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活改變的條件。

2.2 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性的影響 與對(duì)照組比較，MPP+組小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.01）；與MPP+組比較，MPP++Pae（5、25μmol/L）組預(yù)處理后小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的影響 正常狀態(tài)下，吞噬熒光微球的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞較少，見(jiàn)圖1a。經(jīng)MPP+處理后，吞噬熒光微球的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，見(jiàn)圖1b；與對(duì)照組比較，PI明顯增大（P＜0.05）。MPP++Pae（5、25μmol/L）組預(yù)處理后，吞噬熒光微球的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，見(jiàn)圖1d-e；與MPP+組比較，PI均明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖1 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的影響（a：對(duì)照組；b：MPP+組；c：MPP++Pae1μmol/L組；d：MPP++Pae 5μmol/L組；e：MPP++Pae 25μmol/L組）

表2 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的影響

2.4 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 經(jīng)MPP+處理后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6均較對(duì)照組明顯增加（均P＜0.05）。與MPP+組比較，MPP++Pae（5、25μmol/L）組預(yù)處理后BV2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6明顯減少（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的免疫、炎癥效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷十分敏感，其激活先于神經(jīng)元損傷[7]。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈分枝狀，通過(guò)細(xì)長(zhǎng)的突起感受周?chē)h(huán)境的變化并釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等，以維持神經(jīng)元的正常功能。損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，形態(tài)變?yōu)閰病U狀或阿米巴樣。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞受到損傷部位釋放的趨化因子吸引，向損傷部位遷徙增殖；輕度損傷早期，小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放IFN-γ、少量的TNF-α和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，參與神經(jīng)保護(hù)作用；損傷較重時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞早期可釋放大量TNF-α、IL-1β等，加重神經(jīng)損傷；嚴(yán)重?fù)p傷早期，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可吞噬死亡細(xì)胞及其殘片，對(duì)損傷的恢復(fù)與重建有利，但在大量吞噬的同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)釋放大量ROS、TNF-α、IL-1β等細(xì)胞毒性分子，加重神經(jīng)損傷；可見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞具有典型的雙向調(diào)節(jié)作用[7-9]。

小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在PD神經(jīng)炎癥和多巴胺神經(jīng)元損傷中起著重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，并引起神經(jīng)元損傷；損傷的神經(jīng)元釋放毒素，又進(jìn)一步刺激小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步釋放神經(jīng)毒性因子和免疫因子并且彼此擴(kuò)大各自毒性，最終引起多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡，促進(jìn)PD的發(fā)展進(jìn)程[6,10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MPTP誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型中，多巴胺能神經(jīng)元變性的早期就已經(jīng)出現(xiàn)明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞激活[11]。經(jīng)MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液可引起多巴胺能神經(jīng)元損傷，然而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與減少炎癥因子的釋放可明顯減輕神經(jīng)元損傷[12]。此外，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮的吞噬功能對(duì)神經(jīng)元也有損害作用。在6-羥基多巴或魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD模型中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元附近有小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元，減弱小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性則會(huì)減少神經(jīng)元的丟失[13-14]。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的功能對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要意義。

近年來(lái)，中藥及其活性成分在PD治療方面顯示出一定的效果。Pae是從毛茛科植物牡丹皮、蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿中提取出來(lái)的一種中藥單體，目前有研究表明Pae具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用；（1）減輕腦缺血再灌注損傷，改善血腦屏障通透性，抑制活性氧生成，發(fā)揮抗炎作用[15]；（2）減輕阿爾茨海默病動(dòng)物模型腦內(nèi)的炎性損傷，有效改善阿爾茨海默病、血管性癡呆動(dòng)物的認(rèn)知功能障礙；（3）緩解動(dòng)物模型的焦慮抑郁[16-18]；（4）抑制內(nèi)毒素介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥[19]；（5）對(duì)PD神經(jīng)元具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，可減輕魚(yú)藤酮、MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠也有一定的保護(hù)作用[4-5]，但目前尚無(wú)Pae對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用的文獻(xiàn)報(bào)道。

由于小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是PD發(fā)病的重要機(jī)制，因此本研究以BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，研究Pae對(duì)MPP+誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，以探尋一種有效的干預(yù)和藥物作用的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示MPP+可誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖、吞噬活性增強(qiáng)以及炎癥因子釋放；經(jīng)MPP++Pae（5、25μmol/L）預(yù)處理后，可抑制以上效應(yīng)，推測(cè)該作用可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性及抗炎作用有關(guān)。

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Paeonol pretreatment inhibits MPP+induced BV2 microglia activation in Parkinson disease

WANG Hao,ZHANG Zhenzhong,LI

Zhongchun,et al.Department of Neurology,Tongde Hospital of Zhejiang Pronince,Hangzhou 310012,China

Objective To investigate the effects of paeonol on MPP+induced BV2 m icrog lia activation,which is a cell model of Parkinson d isease. Methods After MPP+and paeonol p retreatment,cell viability was detected by CCK-8 assay; m icrog lial phagocytosis was assessed by immunostaining methods,and inflammatory cytokine release was determ ined according to the ELISA kits. Results MPP+treatment(0.1μmol/L)significantly enhanced BV2 m icrog lial cell viability,increased m icrog lial phagocytosis,and enhanced inflammatory cytokine of TNF-α,IL-1β,IL-6 release.Com pared to the MPP+g roup, Paeonol treatment(5,25μmol/L)significantly inhibited the increase of cell viability,dec reased m icrog lial phagocytosis,and reduced TNF-α,IL-1β,IL-6 release. Conclusion Paeonol can p revent MPP+induced BV2 m ic rog lia activation,and the mechanism may be related to inhibitm ic rog lialphagocytosis,and the anti-inflammatory effects.

Paeonol Parkinson d isease Microg lia Inflammatory cytokine

2016-11-04）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-1815

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81401566）；浙江省自然科學(xué)基金（LQ 15H 090005）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2015KYB076）；浙江省中醫(yī)藥管理局科研基金項(xiàng)目（2015ZB012）

310012杭州，浙江省立同德醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（王浩、張震中、李中春）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科（趙冰）

趙冰，E-mail：zhaobingzju@163.com