李國忠，陳創(chuàng)夫

（新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

高分辨率溶解曲線分析結(jié)合COLD-PCR快速檢測綿羊低豐度FecB基因

李國忠，陳創(chuàng)夫*

（新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

本文利用高分辨率熔解曲線分析結(jié)合COLD-PCR建立綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB（BMPR-IB）基因低豐度A746G點突變的檢測方法，為FecB基因大面積高通量篩查提供方便快捷和低成本的檢測技術(shù)。實驗分別提取綿羊BMPR-IB基因A746G點突變陽性純合子和陰性純合子的基因組，分別PCR擴(kuò)增223 bp的目的片段，測定濃度和純度后，分別稀釋至0.05 ng/μL，將陽性純合子用陰性純合子進(jìn)行系列稀釋作為模板標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)模板標(biāo)準(zhǔn)品序列設(shè)計合成3對引物，以標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行COLD-PCR，其產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，生成的歸一化溫度轉(zhuǎn)移差異圖（Normlized and Temp-Shifted Differines Plot）即為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，作為待測樣品FecB檢測的依據(jù)，對其可靠重復(fù)性做了進(jìn)一步驗證。結(jié)果表明：2對引物COLD-PCR HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖曲線分離清晰可靠，檢測下限均為0.5%，與傳統(tǒng)qPCR HRM相比，靈敏度提高到4倍。本實驗建立的綿羊低豐度FecB基因檢測方法可以用于綿羊FecB基因大面積高通量快速篩查工作。

綿羊；FecB基因；COLD-PCR；高分辨率熔解曲線分析

綿羊產(chǎn)羔率屬于閾性狀，由多個基因控制。其中，綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB（Bone Morphogenetic Protein Receptor IB, BMPR-IB）基因發(fā)生第六外顯子A746G單堿基突變后被稱作FecB基因，是影響綿羊產(chǎn)羔率的最重要的主效基因，增羔效應(yīng)最明顯，應(yīng)用最廣泛。Davis等[1]報道，一個拷貝的FecB基因能增加 1.3～1.6個卵，雙拷貝能增加 2.7～3.0個卵；對于產(chǎn)羔數(shù)而言，第1個拷貝能增加窩產(chǎn)羔數(shù)0.7～0.9只，第2個拷貝增加0.4～0.5只。

FecB基因不僅是控制我國小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊等多胎綿羊品種的主效基因，而且有的單胎品種也可能有攜帶FecB的少數(shù)個體，孫紅霞[2]在寧夏灘羊中檢測到低頻率的FecB基因。檢測出這些攜帶有FecB基因的羊只留作種用，對提高產(chǎn)羔率有非常重要的意義。目前報道的檢測方法有AS-PCR、RFLP-PCR、測序和 HRM等[3-5]。這些方法檢測靈敏度較低，一般只用于單只羊的檢測，如果用于羊群大面積篩查，則費時費工，成本太高。本研究先通過低變性溫度共擴(kuò)增PCR（Coamplication at Lower Denaturation Temperature PCR，COLD-PCR）對FecB進(jìn)行有效富集，然后利用高分辨率熔解曲線分析（High Resolution DNA-melting Analysis，HRM）進(jìn)行快速檢測，建立了一種低豐度FecB檢測方法，適用于綿羊FecB基因的高通量大面積篩查工作，并快速鎖定找到攜帶有FecB的羊只，以便選種留種之參考。該法方便快捷，準(zhǔn)確高效，成本低廉。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 羊只血液采集于新疆石河子市屠宰場。用事先含有1 mL ACD 抗凝劑的無菌EP管分別收集15只宰殺湖羊和2只宰殺哈薩克羊的靜脈血液4 mL，-20℃凍存。

1.2 儀器 Light Cycler?480定量PCR儀，BioDoc -It?Imager System凝膠成像系統(tǒng)，DYY－4C電泳儀，BIO-rad C1000 PCR儀，Eppendorf 5415D超速離心機(jī)，Nanodrop 2000分光光度計。

1.3 試劑 通用型柱式基因組提取試劑盒、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和Goadstar DNA Polymerase購自于北京康為世紀(jì)公司，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司，MgCl2購自北京天根生化科技有限公司，LC Green Plus+購自美國Idaho公司。

1.4 基因組的提取 血液基因組的提取按照試劑盒說明進(jìn)行，用分光光度計測定濃度和純度，滿足實驗要求。

1.5 FecB基因檢測 首先根據(jù)FecB基因序列（GenBank登錄號：AF357007.1）設(shè)計1對引物，靶向第六外顯子，PCR產(chǎn)物長度為179 bp。引物序列：F：5'- GGAAACCCTGAACATCGCTAATAC-3'；R：5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'。分別以提取的各綿羊基因組為模板，用高保真酶進(jìn)行普通PCR。PCR反應(yīng)體系 （50 μL）：2×PrimeSTAR GC Buffer（Mg2+plus）25 μL； dNTP Mixture （2.5 mmol/L each） 4 μL；上下游引物（25 umol/L）各0.4 μL；基因組模板1 μL； PrimeSTAR HS DNA Polymerase （2.5 U/μL）0.5 μL；雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 4 min；98℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)；72℃ 5 min。

最后按照試劑盒操作說明，回收PCR產(chǎn)物，用分光光度計測定純度和濃度，送生物工程（上海）股份有限公司測序，選取質(zhì)量良好的FecB陽性純合子和陰性純合子基因組，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備 首先根據(jù)綿羊FecB基因序列，靶向其第六外顯子設(shè)計合成1對引物223-L/223-R，PCR產(chǎn)物長223 bp，引物序列：223-L：5'-TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA-3'；223-R:5'-AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAAC C-3'。然后分別以經(jīng)過測序檢測為FecB陽性純合子和陰性純合子的備用基因組為模板，用高保真酶PCR擴(kuò)增目的序列。PCR反應(yīng)體系 ( 50 μL )：2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg2+plus) 25 μL ；dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 5 μL ；上下游引物（25 umol/L）各0.5μ L ；基因組模板1 μL； PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.6μL ；雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 4 min；98℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 20 s，共30個循環(huán)；72℃ 5 min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，按照快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明，回收223 bp的目的序列，用Nanodrop 2000分光光度計測定純度和濃度，優(yōu)先選取純度最高的回收產(chǎn)物用于后續(xù)實驗。

最后用滅菌雙蒸水將回收的223 bpPCR產(chǎn)物稀釋至0.05 ng/μL；然后按照一定的比例混合，使得FecB陽性率分別為100%、50%、25%、20%、15%、10%、5%、2.5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%和0%，作為后續(xù)定量PCR的模板標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 引物設(shè)計合成 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品模板的序列設(shè)計合成3對引物，使FecB基因的A746G突變單堿基位于擴(kuò)增產(chǎn)物的大概中間位置。引物HPLC純化。普通PCR檢測引物的擴(kuò)增效率和特異性。引物序列和擴(kuò)增片段長度見表1。

1.8 qPCR HRM基因分型 用合成的3對引物和100%、50%和0%的模板標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行普通定量PCR結(jié)合HRM分型實驗。此操作在Light Cycler?480上閉管完成。

1.8.1 qPCR qPCR的體系為：5×Goadstar Buffer 4 μL，超純dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.2 μL，上下游引物（25 μmol/L ）各0.2 μL，標(biāo)準(zhǔn)品模板0.3 ng，Goadstar Taq Polymerase （5 U/μL）0.2 μL，10xLC Green Plus+ 1 μL，雙蒸水補(bǔ)足20 μL。qPCR 反應(yīng)程序：95℃ 10 min； 95℃ 20 s，退火（表1）25 s（Fluorescence Reading），72℃ 15 s，共35個循環(huán)；72℃ 3 min。

表1 普通定量PCR（qPCR）和COLD-PCR引物

1.8.2 HRM 分型 HRM分析程序：95℃ 30 s，40℃ 4 min，65℃ 1 s，90℃（25次Fluorescence Reading/℃），40℃ 1 min。Light Cycler?480 自帶軟件進(jìn)行掃描分析，生成Normlized and Temp-Shifted Differienc Plot圖，依據(jù)該圖分型。

1.8.3 qPCR HRM基因分型的靈敏度 100%、50%、25%、20%、10%、5%、2%、1%和0%標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用引物Primer1和Primer3進(jìn)行qPCR HRM基因分型，以檢測qPCR HRM的靈敏度。PCR反應(yīng)體系條件和HRM分析程序同上。

1.9 COLD-PCR HRM檢測低豐度FecB基因

1.9.1 COLD-PCR條件的優(yōu)化 COLD-PCR HRM檢測效果受Tc值、Mg2+濃度、雜交時間、熒光染料、模板和引物質(zhì)量等多方面的影響[6]。本實驗Tc值根據(jù)前人經(jīng)驗[7]，以Tm-1為基礎(chǔ)，在其上下游設(shè)定Tc梯度，通過COLD-PCR擴(kuò)增效率和 HRM分析的效果確定最佳Tc值。Mg2+濃度優(yōu)化：以qPCR體系含Mg2+濃度分別為1.5、2.0、3.0、3.5 mmol/L，優(yōu)化最佳濃度。雜交時間設(shè)為40 s，2 、4 min 和7 min，進(jìn)行優(yōu)化；LC Green Plus+量均為0.5x。

1.9.2 COLD-PCR COLD-PCR體系：和qPCR相同。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 10 min； 先運行5個普通PCR循環(huán)：95℃ 20 s，退火溫度（表1）25 s（Fluorescence Reading），72℃ 15 s；然后35個COLD-PCR循環(huán)：95℃ 20 s，68℃ 40 s，Tc溫度（表2）20 s ，退火溫度（表1）25 s（Fluorescence Reading），72℃ 15 s；72℃ 5 min。

1.9.3 HRM 分析 HRM 分析程序與前面相同。Light Cycler?480自帶軟件進(jìn)行Gene Scaning分析，生成FecB基因檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到清晰的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，重復(fù)一次實驗，檢測其穩(wěn)定重復(fù)性。

2 結(jié)果分析

2.1 FecB檢測 經(jīng)測序，15只湖羊中有2只為FecB陽性純合子，哈薩克羊均為陰性純合子。選取濃度高純度高的FecB陽性純合子和陰性純合子基因組用于后續(xù)實驗。

2.2 qPCR HRM分型結(jié)果 3對引物的分型圖清晰，效果較好（圖1）。各基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證正確無誤。qPCR HRM檢測下限一般為5%～10%[8]，本實驗用引物Primer1和Primer3做了檢測靈敏度分析，結(jié)果顯示，檢測下限均為2%（圖2）。

2.3 COLD-PCR條件的優(yōu)化 各對引物PCR產(chǎn)物的Tm值和COLD-PCR最佳Tc值見表2。

經(jīng)濃度梯度的實驗檢測，本實驗Mg2+的最佳濃度為1.5 mmol/L（Bufffer自帶），額外增加Mg2+使擴(kuò)增效率和特異性均下降；早期報道的COLDPCR異源雙鏈雜交時間一般為數(shù)分鐘，近年，有研究用PhusionTMHigh-fidelity Polymerase或HotStar Taq DNA Polymerase等酶及其Buffer，最佳雜交時間降為30 s[9-11]，這可能和所使用的試劑有關(guān)。本實驗最佳雜交時間為40 s，如果延長時間則PCR特異性下降，熔解峰圖凌亂，這可能與Buffer組成等有關(guān)，降低了雜交所需必要時間。

表2 2對引物PCR產(chǎn)物的Tm值和COLD-PCR的 Tc值 ℃

2.4 COLD-PCR HRM檢測結(jié)果 用Primer1和Primer2引物以及優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行COLDPCR HRM分析，結(jié)果見圖3（a和b、c和d、），COLD-PCR HRM檢測靈敏度均為0.5%，與傳統(tǒng)定量PCR HRM相比，靈敏度提高到4倍。用Primer1引物進(jìn)行的獨立重復(fù)實驗（圖3 e和f）表明，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有重復(fù)穩(wěn)定性。

3 討 論

本實驗建立的qPCR HRM方法，適用于檢測單只或少數(shù)羊只混合樣品的FecB情況；建立的COLD-PCR HRM低豐度檢測方法，除此之外，還適用于大面積高通量篩查工作。本文2對引物的COLD-PCR HRM檢測方法，靈敏度均為0.5%。羊為二倍體，所以，如果將每只羊的基因組等量混合制作混合池，以此作為模板，1個PCR反應(yīng)樣孔1次最多檢測100只羊。按此計算，如果用96孔板，一次PCR反應(yīng)即可完成數(shù)千甚至近萬只羊FecB總頻率的檢測，非常方便快捷，而且成本低廉。如果想要在陽性混合樣本中，找出到底哪只或哪些羊只攜帶有FecB，可以將樣本分成若干組，每組再檢測一次，縮小范圍，這樣，可以快速鎖定并找出陽性個體，最后測序驗證。另外，經(jīng)獨立實驗驗證，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具有重復(fù)穩(wěn)定性，這為FecB基因

選種育種帶來便利。

圖1 qPCR HRM 分型結(jié)果

本實驗中，與傳統(tǒng)PCR相比，COLD-PCR將高分辨率熔解曲線分析的靈敏度提高到4倍。COLD-PCR對反應(yīng)孔溫的精確控制有很高要求，而本實驗所用定量PCR儀溫度設(shè)置只能設(shè)整數(shù)值，所以最佳Tc的摸索和設(shè)定受到了限制，有可能限制了突變富集的程度。 Milbury等[10]在COLD-PCR的基礎(chǔ)上，建立了ice-COLD-PCR；Kit等[11]進(jìn)一步發(fā)展了ice-COLD-PCR，提出了E-ice-COLDPCR的方法，降低了對定量PCR儀控溫性能的要求，并提高了突變富集程度[12-13]。但這些方法下游結(jié)合HRM檢測的技術(shù)還未見報道。

圖3 COLD-PCR HRM檢測結(jié)果

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S826.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-122

2016-12-07；

2017-04-25

李國忠（1968-），男，新疆石河子人，博士研究生，主要從事動物轉(zhuǎn)基因研究，E-mail: lgz8791@163.com

* 通訊作者：陳創(chuàng)夫（1964-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事病原微生物分子機(jī)制研究，E-mail: ccf－xb@ 163.com

圖2 qPCR HRM檢測靈敏度