招麗蓉 王 巍 伍 婧 胡 斌 林秀強(qiáng) 徐綺華 林 奔 馮 芬 陳永昌

VEGF的SNP狀態(tài)預(yù)測(cè)貝伐株單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的長(zhǎng)期療效

招麗蓉 王 巍 伍 婧 胡 斌 林秀強(qiáng) 徐綺華 林 奔 馮 芬 陳永昌

目的 檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，探討VEGF的SNP與患者預(yù)后的關(guān)系。方法 60例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的外周血樣本，均接受過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化療，其中20例加用了貝伐珠單抗，應(yīng)用MassARRAY方法，成功進(jìn)行9個(gè)VEGF的SNP的檢測(cè)，包括-2578C>A、-460T>C、-1455T>C、-1154G>A、-634G>C、-398G>A、-497T>C、-2455>-T、-936C>T。結(jié)果 60例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，聯(lián)合靶向治療組的總生存期優(yōu)于單用化療組(P=0.01)，VEGF各SNP變異率與NDBI數(shù)據(jù)庫(kù)相似，-1455T>C 變異率極低，無(wú)臨床價(jià)值；-2578C>A和-460C>T變異具有較高一致性；入組患者中SNP-497TT純合子患者總生存期劣于其他患者(P=0.02)；應(yīng)用貝伐株單抗患者，SNP-497 3種基因型總生存期均有明顯差異(P=0.01)，SNP-398AA純合變異者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.02)SNP—2455 CC純合子者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.01)。結(jié)論 在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，外周血VEGF的SNP狀態(tài)與貝伐珠單抗以及化療的長(zhǎng)期療效可能相關(guān)，需要進(jìn)一步增加病例，加強(qiáng)這方面的研究。

轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌；貝伐珠單抗；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子：基因多態(tài)性

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:531～535)

在中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢(shì)[1]，治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的主要方法是化療聯(lián)合靶向治療。其中貝伐珠單抗通過(guò)特異性結(jié)合患者外周血內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)起血管靶向治療作用，使患者中位生存期延長(zhǎng)到2年以上[2]，但貝伐株單抗價(jià)格較貴，且有心腦血管損傷等比較嚴(yán)重的副作用[3]。無(wú)論是化療還是貝伐珠單抗，仍無(wú)公認(rèn)的療效或毒性預(yù)測(cè)因子。國(guó)外有研究顯示，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在接受貝伐單抗聯(lián)合伊立替康為基礎(chǔ)化療后，VEGF-2578 AA和VEGF-1154 AA基因型預(yù)后較好[4]，但相關(guān)研究較少。本研究針對(duì)60例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，測(cè)定其治療前VEGF基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，進(jìn)行長(zhǎng)期生存隨訪，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

自2011年1月至2015年12月在佛山市第一人民醫(yī)院治療的60例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，有可評(píng)價(jià)的病灶，接受正規(guī)一線化療。

60例患者中男性35例，女性25例；年齡33～73歲，中位年齡58歲；ECOG體能狀況評(píng)分均≤2，其中38例應(yīng)用以?shī)W沙利鉑為基礎(chǔ)化療方案(mFOLFOX6或者Xelox),22例應(yīng)用FOLFIRI化療方案。根據(jù)相應(yīng)化療方案，其中20例聯(lián)合貝伐珠單抗治療，應(yīng)用5 mg/kg體重，靜脈滴注每2周1次，或者7.5 mg/kg靜脈滴注，每3周1次。化療之前留取患者血標(biāo)本，化療之后進(jìn)行密切隨訪。

1.2 儀器與試劑

基因擴(kuò)增儀(Bio-rad)，MassARRAY質(zhì)譜分析儀(sequenom)，MassARRAY微量點(diǎn)樣儀(sequenom)，complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set 10*384(sequenom)，快速DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，引物和探針(Thermo Fisher scientific)。

1.3 目標(biāo)SNP及引物設(shè)計(jì)

針對(duì)有報(bào)道的VEGF的10個(gè)常見(jiàn)SNP進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)MassARRAY實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)兩條擴(kuò)增引物實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段的擴(kuò)增，另外針對(duì)每個(gè)SNP還需要設(shè)計(jì)一條單堿基延伸反應(yīng)引物，延伸引物位于變異位點(diǎn)前一個(gè)堿基，在變異位點(diǎn)處可延伸一個(gè)堿基(表1)。用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)可區(qū)分延伸堿基的分子量，從而判斷目的基因是否變異。具體見(jiàn)表1。

表1 MassARRAY引物及探針設(shè)計(jì)表

1.4 檢測(cè)流程

樣本收集：收集外周血，4 000 rmp離心10 min，去除血清，將白膜層收集用紅細(xì)胞裂解液處理后，將白細(xì)胞保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 DNA提取和鑒定 使用快速DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取白細(xì)胞的總DNA。Nanodrop 2000分光光度計(jì)定量檢測(cè)基因組DNA純度、濃度；并使用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的降解狀況。

1.4.2 質(zhì)譜分析引物設(shè)計(jì) 質(zhì)譜分析軟件設(shè)計(jì)，具體見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：PCR緩沖液(10×)0.5 μL、Mgcl2(25 mM)0.4 μL、dNTPs(25 mM)0.1 μL、PCR熱啟動(dòng)酶(5 U/μL)0.2 μL、擴(kuò)增引物混合液1 μL、基因組DNA(10 ng/μL)2 μL，水補(bǔ)足至5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。SAP化處理：蝦堿性磷酸酶(shrimp alka-line phosphatase，SAP)去除PCR 產(chǎn)物中dNTP。在PCR 產(chǎn)物中加入SAP(1.7 U/μL)0.3 μL、SAP 緩沖液(10×)0.17 μL、水補(bǔ)足至7 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。單堿基延伸反應(yīng)：上述得到的產(chǎn)物中加入iplex緩沖液(10×)0.2 μL、iplex terminator 0.2 μL、iplex 酶0.041 μL、延伸引物混合液0.94 μL、水補(bǔ)足至9 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s；[94 ℃ 5 s、(52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s)5個(gè)循環(huán)]，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。樹(shù)脂純化：在產(chǎn)物中加16μL水，將清潔樹(shù)脂平鋪到6 mg的樹(shù)脂板中(96 孔板)，將樹(shù)脂倒入延伸產(chǎn)物中，封膜，旋轉(zhuǎn)板30～60 min 進(jìn)行脫鹽去離子防干擾處理；3000×g離心5 min，使樹(shù)脂沉入孔底部。芯片點(diǎn)樣及檢測(cè)：MassARRAY系統(tǒng)點(diǎn)樣儀對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行芯片點(diǎn)樣，利用分析儀掃描芯片。數(shù)據(jù)分析：掃描結(jié)果以Typer 4.0軟件分析。根據(jù)變異位點(diǎn)處堿基分子量不同，時(shí)間飛行質(zhì)譜掃描區(qū)分各目的基因的變異狀況，在質(zhì)譜峰變異堿基處出現(xiàn)峰，則判斷為變異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)t檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-meier法進(jìn)行Log Rank生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 變異頻率

結(jié)果顯示成功檢測(cè)的60個(gè)結(jié)直腸癌樣本9個(gè)SNP檢測(cè)匯總及變異頻率分布，總體來(lái)講，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)變異率相似。值得注意的是，-2578C>A和-460C>T變異具有較高一致性(59/60 98.3%)，60例患者中59例在純合、雜合變異及純合變異3個(gè)方面完全一致，應(yīng)用了貝伐珠單抗的患者兩個(gè)SNP位點(diǎn)變異狀態(tài)完全一致，見(jiàn)表2。

表2 60個(gè)結(jié)直腸癌樣本MassARRAY測(cè)SNP匯總

2.2 生存分析

總體患者及應(yīng)用貝伐株單抗治療的患者均進(jìn)行了生存分析，中位總生存期(OS)為16.0個(gè)月(95% CI:9.3～22.7)；聯(lián)合貝伐株單抗患者中位OS 34.0個(gè)月(95% CI:26.5～44.4)，單用化療組中位OS為12.7個(gè)月(95% CI:10.8～14.6)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)，見(jiàn)圖1；在所有患者中SNP-497TT純合子患者總生存期差于其他患者(P=0.02)見(jiàn)圖2；在應(yīng)用貝伐株單抗患者，SNP-497 3種基因型總生存期均有明顯差異(P=0.01)見(jiàn)圖3，SNP-398AA純合變異者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.02)見(jiàn)圖4，SNP-2455 CC純合子者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.01)見(jiàn)圖5。

圖1 不同治療方案患者生存期比較

圖2 研究人群中SNP-497TT純合子患者總生存期

圖3 應(yīng)用貝伐株單抗患者SNP-497三種基因型總生存期

圖4 應(yīng)用貝伐株單抗患者SNP-398AA純合變異者 總生存期

圖5 應(yīng)用貝伐株單抗患者SNP-2455CC純合子者 總生存期

3 討論

經(jīng)過(guò)科學(xué)界的不斷努力，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的中位生存期已經(jīng)達(dá)到30月左右[5]。貝伐珠單抗在其中起到重要作用，但價(jià)格昂貴，有腦白質(zhì)變性、心血管事件和腸穿孔等多種嚴(yán)重并發(fā)癥[6-7]，急需要找出療效因子指導(dǎo)醫(yī)生合理應(yīng)用。多項(xiàng)大型Ⅲ期臨床試驗(yàn)(AVF2107g，AVAiL,AVOREN，E4599)的回顧性分析結(jié)果是陰性的，無(wú)論是腫瘤組織的免疫組化表達(dá)，還是治療前血漿基線VEGF濃度水平，均與貝伐珠單抗的療效無(wú)明確相關(guān)性[8]。

由于免疫組化的先天局限性，加上貝伐珠單抗在外周血結(jié)合VEGF的特性，近年的研究集中于外周血的療效預(yù)測(cè)因子。Willett等開(kāi)展的一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)[9]顯示，32例局部直腸癌患者接受貝伐珠單抗單藥治療后的血漿VEGF濃度較治療前升高，且可能與原發(fā)灶和淋巴結(jié)縮小有一定關(guān)系，而單獨(dú)接受標(biāo)準(zhǔn)放化療的患者治療前后血漿VEGF濃度無(wú)明顯變化。因此有可能治療前后血漿VEGF濃度變化水平，跟貝伐單抗療效相關(guān)性更大，但VEGF濃度測(cè)定比較麻煩，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，抽血的時(shí)間點(diǎn)很難確定，需要多次抽血。

同時(shí)，VEGF存在多個(gè)SNP，在乳腺癌治療研究中，評(píng)價(jià)了VEGF基因多態(tài)性與藥物療效及毒性之間的關(guān)系，該試驗(yàn)在兩個(gè)治療組中對(duì)所有候選基因型與療效進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-2578和-1154位點(diǎn)均位于VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域，純合子變異者在貝伐株單抗治療組中預(yù)示患者中位OS更長(zhǎng)，但在對(duì)照組中這兩種基因型均未提示與患者PFS和RR有關(guān)[10]。

關(guān)于腸癌的回顧性分析[4]亦發(fā)現(xiàn)，在接受貝伐單抗聯(lián)合伊立替康為基礎(chǔ)治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，VEGF-2578 AA和-1154 AA純合子變異基因型預(yù)示較好的生存。研究的缺陷是僅僅分析了化療聯(lián)合貝伐單抗治療的轉(zhuǎn)移性直腸癌患者，并沒(méi)有對(duì)單獨(dú)化療的生存進(jìn)行比較；但后來(lái)又發(fā)表的另兩項(xiàng)類似研究[11-12]中，VEGF的SNPs與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌療效相關(guān)性仍不確定。

國(guó)內(nèi)這方面的文獻(xiàn)還比較少，因此本研究納入了60例患者進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于VEGF基因區(qū)域的10個(gè)SNP，MassARRAY成功檢測(cè)出9個(gè)位點(diǎn)的SNP狀況，其變異狀態(tài)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)相似，rs833062T>C位點(diǎn)變異率低于1%，無(wú)臨床意義；-2578C>A和-460C>T變異具有較高一致性(59/60 98.3%),在應(yīng)用了貝伐珠單抗的患者兩個(gè)位點(diǎn)狀態(tài)完全一致，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，亟待下一步擴(kuò)大試驗(yàn)例數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

在全體患者進(jìn)行生存分析，可以看到貝伐珠單抗顯著延長(zhǎng)了患者生存期；在所有患者中SNP-497TT純合子患者總生存差于其他患者(P=0.02)；在應(yīng)用貝伐株單抗患者，SNP-497三種基因型總生存均有明顯差異(P=0.01)，SNP-398AA純合變異者總生存優(yōu)于其他患者(P=0.02)，SNP-2455 CC純合子者總生存優(yōu)于其他患者(P=0.01)，-2578AA純合子者1例仍存活，預(yù)后最好，但與其他患者差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果似乎與國(guó)外學(xué)者報(bào)道并不一致，但在僅有的20例接受貝伐株單抗聯(lián)合化療的患者，不同SNP基因型之間確實(shí)存在生存期差別，值得進(jìn)一步增加病例和SNP數(shù)量。

下一步研究者已經(jīng)開(kāi)始前瞻性留取應(yīng)用貝伐珠單抗治療者的血標(biāo)本，同時(shí)增加研究中心數(shù)量，有條件時(shí)開(kāi)展VEGF血清動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，力爭(zhēng)早日獲得貝伐珠單抗療效的預(yù)測(cè)因子。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between Peripheral Blood VEGF Promoter Region SNP and Prognosis of Patients with Metastatic Colorectal Cancer

ZHAOLirong，WANGWei,WUJing,etal.

TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan,528000

Objective To detect single nucleotide polymorphism (SNP)in vascular endothelial growth factor (VEGF)promoter region in metastatic colorectal cancer patients，and explore the relationship between the SNP and prognosis.Methods Peripheral blood samples were taken from 60 metastatic colorectal cancer patients in our hospital.These patients received standard chemotherapy.20 cases received chemotherapy plus bevacizumab.Three SNPs in VEGF promoter region were detected successfully by MassARRAY method,including-2578C> A,-460T> C and-1455T> C.Results The over survival (OS)in 20 cases with bevacizumab was better than other cases (34.0m vs 12.7m),(P=0.004).The SNP status for each site was similar with NDBI database.-2578C> A and-460C> T mutation had a high consistency in the overall patient.Patients with-497 TT genotype had worse overall survival than other patients (P =0.02).In the patients received bevacizumab,three SNP-497 genotypes related to three significantly different prognosis(P=0.01),SNP-398AA homozygous variation related to superior overall survival (P=0.02),SNP-2455 CC homozygotes related to better overall survival (P=0.01).Conclusion In metastatic colorectal cancer,the VEGF SNP status may be related to the long-term efficacy of bevacizumab and chemotherapy.A further research with more cases is needed to test our hypotheses.

Metastatic colorectal cancer;Bevacizumab;Vascular endothelial growth factor(VEGF)；Single nucleotide polymorphism(SNP)

佛山市科技局科研項(xiàng)目(編號(hào)：2014AB00278)

528000 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院

王 巍

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.003

R735.3+7

A

1001-5930(2017)04-0531-05

2017-01-16

2017-03-02)