劉婷，黨楊杰，劉利敏，張磊，付愛萍，張玉明，吳笛,杜銳，孫世仁

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 腎內(nèi)科，國家腫瘤重點實驗室 陜西 西安 710032； 2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院麻醉科陜西 西安 710032； 3.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅；4.海軍總醫(yī)院腫瘤診療中心 北京 100048)

·論 著·

腎小管上皮細胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用

劉婷1，黨楊杰2，劉利敏1，張磊1，付愛萍1，張玉明1，吳笛3,杜銳4，孫世仁1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 腎內(nèi)科，國家腫瘤重點實驗室 陜西 西安 710032； 2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院麻醉科陜西 西安 710032； 3.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅；4.海軍總醫(yī)院腫瘤診療中心 北京 100048)

目的：探討腎小管上皮細胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用。方法：體外實驗，人腎小管上皮細胞(HK2)分別置于常氧21%和缺氧1%的孵箱里，培養(yǎng)24，48 hrs。采用流式細胞術(shù)檢測缺氧48 hrs后上皮細胞的周期分布；采用Western blot法檢測Collagen4A1(COL4A1)及α- 平滑肌肌動蛋白(α- SMA)的蛋白表達水平。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)14 d小鼠模型，HE及Masson染色觀察腎組織病理改變及纖維化程度，免疫組化染色觀察α- SMA的表達及部位；Western blot檢測低氧標記分子HIF- 1α、細胞周期蛋白cyclinB1和cyclinD1的蛋白水平。結(jié)果：與常氧組比較，缺氧組腎小管上皮細胞G2/M期比例增高(P<0.05)，同時α- SMA和COL4A1的蛋白表達水平增高(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，HE及Masson染色顯示模型組腎組織纖維化程度增高，α- SMA的表達增高且主要分布在間質(zhì)中；Western blot結(jié)果顯示：HIF- 1α及G2/M期標記物cyclinB1/cyclinD1比值增加。結(jié)論：腎小管上皮細胞G2- M期阻滯參與缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。

缺氧； G2- M阻滯； 腎小管上皮細胞； 腎間質(zhì)纖維化

腎間質(zhì)纖維化是各種慢進腎臟病發(fā)展至終末期腎臟病的主要病理變化和共同通路[1]，以炎細胞浸潤，成纖維細胞的激活和增殖，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積[2]，腎臟固有細胞消失以及微血管減少為特征。近來研究發(fā)現(xiàn)，缺氧損傷是影響腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素和重要途徑[4]，大量研究發(fā)現(xiàn)缺氧有可能通過細胞表型發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、啟動炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答，刺激成纖維細胞增殖和能量代謝障礙，導(dǎo)致纖維化相關(guān)因子大量釋放和細胞外基質(zhì)合成與降解失衡最終促進腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[3- 5]，但我們研究發(fā)現(xiàn)缺氧能誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生G2/M期阻滯，提示除了以上途徑外，缺氧還可能通過其他機制參與腎間質(zhì)纖維化的過程。因此本研究旨在闡明缺氧能通過腎小管上皮細胞G2/M期阻滯參與腎間質(zhì)纖維化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HK2細胞購于上海細胞庫，流式細胞儀由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室提供。HIF- 1α(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、羊抗兔α- SMA抗體(abcam公司)、羊抗兔Collagen4A1(COLA1)抗體(上海生工)和β- actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔IgG- HRP Santa Cruz公司；F12培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(浙江天杭生物),HE染色試劑盒(北京藍博斯特生物技術(shù)有限公司)及病理特殊染色液套組Masson三色染色液試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞于含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，消化傳代如常。以1×105/瓶接種于25 cm2的大皿，生長至70%- 80%時，換成無血清F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 hrs以達到同步化處理。細胞分為常氧組(氧濃度21%)和缺氧組(1% O2)，將缺氧組細胞置于1% O2、5% CO2、37 ℃的缺氧孵箱中培養(yǎng)24 hrs、48 hrs，常氧組細胞置于21% O2、5% CO2、37 ℃的常氧孵箱中培養(yǎng)24 hrs、48 hrs。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 常規(guī)消化分組處理人腎小管上皮細胞，48 hrs 后收集細胞并加入2 mL PBS吹懸后離心，重復(fù)加PBS洗一次，棄上清后加入2 mL無水乙醇和1 mL PBS吹勻細胞，置于4 ℃冰箱固定過夜，次日送檢。

1.2.3 Western blot法檢測 HIF- 1α、α- SMA、COL4A1、cyclinB1、cyclinD1的蛋白表達：將常氧組及缺氧組細胞用4 ℃預(yù)冷的PBS洗一遍，置于冰上，然后分別加入200 μL的RIPA裂解液，將細胞用細胞刮刮下，加入1.5 mL離心管中，置于冰上裂解15 mins后用超聲槍吹打5- 7次，再裂解10 mins，隨后4 ℃下12 000 r·min-1離心20 mins，取上清。留取30 μL采用BCA法測定上清中蛋白量，其余上清中加入1/4體積的5×上樣緩沖液，混勻后置于上100 ℃ 5 mins，即為制備好的蛋白樣品，于- 20 ℃冰箱保存。取假手術(shù)組及模型組小鼠左側(cè)腎組織，加裂解液后勻漿，離心，取上清，測蛋白濃度，加各組蛋白上樣液進行SDS- PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，室溫封閉液封閉1 h，分別加一抗，β- actin(1∶1 500,Bioss,China),HIF- 1α(1∶400,Bioss,China)，a-SMA(1∶1 000,Abcam),COL4A1(1∶300,SangonBiotech.Co.),cyclinB1(1∶200,SangonBiotech.Co.)，cyclinD1(1∶500,SangonBiotech.Co.)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，與HRP標記的二抗孵育1h，TBST洗膜3次,最后ECL顯色。

1.2.4 動物模型 雄性C57小鼠(由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，6- 8周，體重20- 25g。實驗前小鼠維持12hrs晝夜交替周期的標準條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度40%～70%，自由進食、飲水。實驗期間動物自由飲用自來水，進食標準顆粒飼料，術(shù)前12hrs禁食，自由飲水。將小鼠隨機分為兩組：假手術(shù)組(6只)及模型組(6只)。選用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)致腎間質(zhì)纖維化模型，即:用1.5%的戊巴比妥鈉按50mg·kg-1腹腔麻醉動物，固定，去毛消毒后打開左側(cè)腹腔并雙重結(jié)扎左側(cè)輸尿管，消毒后縫合傷口，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組麻醉后打開腹腔，分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎，消毒后縫合傷口，關(guān)閉腹腔。于手術(shù)后14d麻醉灌注后處死兩組小鼠，取梗阻側(cè)腎臟，部分組織固定于4%多聚甲醛中待免疫組化染色，剩余組織保存于-80 ℃冰箱中蛋白分析。

1.2.5HE及Masson染色 用HE染色試劑盒(北京藍博斯特生物技術(shù)有限公司)及病理特殊染色液套組Masson三色染色液試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)說明書進行染色。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用0.3%甲醇-H2O2液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用枸櫞酸緩沖液微波煮沸法進行抗原修復(fù)，然后用血清封閉30mins，加入一抗anti-a-SMA(1∶650,Abcam)，于4 ℃冰箱過夜。次日加生物素標記的二抗，室溫1h，滴加鏈霉親和素- 過氧化物酶封閉30mins,DAB顯色后，蘇木素襯染細胞核，自來水沖洗后，常規(guī)脫水，透明，封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 缺氧刺激HK2細胞G2/M期比例增加

通過流式細胞術(shù)檢測常氧組和缺氧組細胞培養(yǎng)48 hrs后周期比例的變化，結(jié)果顯示，缺氧組G2/M期細胞比例(11.96±0.07)高于常氧組G2/M期細胞比例(6.47±1.16)(圖1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 缺氧刺激HK2細胞表達纖維化因子COL4A1及α- SMA

通過Western blot方法檢測常氧組和缺氧組細胞培養(yǎng)24 hrs及48 hrs后，纖維化因子COL4A1及α- SMA的蛋白表達水平。結(jié)果顯示與常氧組(0 h)相比，缺氧組細胞纖維化因子COL4A1及α- SMA在缺氧不同時間點蛋白表達增加(圖2A、B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(aP<0.05)。

2.3 UUO模型腎臟間質(zhì)纖維化的程度

HE染色顯示模型組腎小管擴張，小管上皮細胞變性或壞死，炎癥細胞浸潤(圖3A、B、)；Masson染色顯示UUO 14 d腎間質(zhì)發(fā)生明顯纖維化(圖3C、D)；α- SMA在模型組顯著高表達，并且主要定位于間質(zhì)中(圖3E、F)。

2.4 UUO模型HIF- 1α及細胞周期蛋白的表達

與假手術(shù)組比較，模型組HIF- 1α表達增加，細胞周期蛋白cyclinB1表達增加而cyclinD1的表達降低(圖4A、B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(aP<0.05)。cyclinB1與cyclinD1的比值是G2/M期的標記物，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，cyclinB1/cyclinD1在UUO 14 d后表達增加(圖4C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(aP<0.05)，即G2/M期細胞比例增加。

圖1 流式細胞術(shù)檢測常氧組和缺氧組細胞周期比例的變化

Fig 1 To detect the cell cycle distribution of HK2 cells by flow cytometry in normoxia and hypoxia group

A、B. Western blot方法檢測常氧組和缺氧組細胞纖維化因子COL4A1及α- SMA的蛋白表達水平

A、B. To examine the protein level of COL4A1and α- SMA in normoxia and hypoxia group by Western blot

圖2 缺氧刺激HK2細胞表達纖維化因子COL4A1及α- SMA

Fig 2 Hypoxia induced the expression of COL4A1and α- SMA in HK2 cells

A、B.HE染色觀察假手術(shù)組(sham組)及模型組(UUO 14 d)腎組織病理改變；C、D.Masson染色觀察假手術(shù)組及模型組腎臟纖維化程度；E、F.免疫組化染色觀察假手術(shù)組及模型組腎組織α- SMA表達及部位(n=6×400)。

A、B.Observed the pathological changes by HE in sham and UUO group. C、D.Observed renal tissue fibrosis degree by Masson staining in sham and UUO group.E、F.The expression and distribution of α- SMA was detected by immunohistochemical staining in sham and UUO group(n=6×400).

圖3 UUO模型腎臟纖維化程度的觀察

Fig 3 Observed renal tissue fibrosis degree in sham and UUO group

A．Western blot法檢測模型組HIF- 1α及細胞周期蛋白cyclinB1及cyclinD1的表達；B.定量分析UUO 14 d后HIF- 1α的表達；B.定量分析UUO 14 d后cyclinB1/cyclinD1的比值變化(n=6)。

A．To detect the expression of HIF- 1α、cyclinB1and cyclinD1by Western blot. B. Quantitatively analysis the expression of HIF- 1α at 14 days after UUO.B. Quantitatively analysis the rate of cyclinB1/cyclinD1(n=6).

圖4 UUO模型HIF- 1α及細胞周期蛋白的表達變化

Fig 4 To detect the expression of HIF- 1α、cyclinB1and cyclinD1 in UUO model

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化以大量細胞外基質(zhì)過度沉積為特點[6]，研究表明，慢性缺氧是發(fā)展到終末期腎病的最終共同通路，并且，慢性缺氧可以通過調(diào)節(jié)促纖維化基因的表達、刺激成纖維細胞增殖、促進上皮細胞發(fā)生上皮細胞轉(zhuǎn)分化、促進能量代謝障礙，炎癥及免疫應(yīng)答加速腎臟纖維化的發(fā)生[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期阻滯是腎臟纖維化發(fā)生的重要病因之一[8- 11]，也越來越引起研究者的關(guān)注，但是目前還很少有研究關(guān)注缺氧所致腎臟纖維化是否與細胞周期阻滯相關(guān)。參照文獻我們通過1%氧濃度的缺氧孵箱建立細胞缺氧模型，通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立梗阻性腎損傷腎間質(zhì)纖維化模型，本研究HE、masson染色及Western blot檢測低氧標記分子HIF- 1α，均提示缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型制備成功。

我們通過Western blot檢測缺氧后COL4A1及α- SMA的表達。腎間質(zhì)中膠原含量被人們廣泛地用于評估纖維化嚴重程度，如CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ及Collagen4A1等。肌成纖維細胞激活后可以產(chǎn)生大量膠原，是腎臟纖維化發(fā)生的重要機制之一，α- SMA是肌成纖維細胞的標記物，作為評估腎纖維化的另一重要細胞因子[12]，因此，本實驗選用COL4A1及α- SMA作為評估腎纖維化的重要細胞因子。本實驗結(jié)果表明，與常氧組比較，缺氧組細胞COL4A1及α- SMA在缺氧后的腎臟高表達。與假手術(shù)組比較，模型組高表達α- SMA且主要分布于間質(zhì)中。

細胞周期是進入增殖的細胞，通過一系列有序的事件最終實現(xiàn)細胞分裂，產(chǎn)生兩個子細胞的過程，可以分為分裂期和間期，間期又包括G1期、S期和G2期。細胞能否順利完成增殖過程與細胞能否順利的從上一個階段進入下一個階段密切相關(guān)，這些過程受到嚴密的調(diào)控[13]。我們通過流式細胞術(shù)檢測HK2細胞缺氧48 hrs之后G2/M期細胞比例，研究發(fā)現(xiàn)，與常氧組比較，缺氧組細胞G2/M期細胞比例顯著增加，提示腎小管上皮細胞G2/M期阻滯可能參與缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)急性短暫缺氧時，誘發(fā)的腎損傷可以通過小管上皮細胞去分化、增生得到修復(fù)使腎功能恢復(fù)，然而，長期慢性缺氧通常使得小管發(fā)生異常修復(fù)過程，損傷的小管上皮細胞大量阻滯在G2/M期，未能順利進入下一階段，阻滯的細胞刺激纖維化因子TGF- β，CTGF及膠原大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[14]。

細胞周期蛋白及細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶在保證細胞周期有序進展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，細胞周期蛋白隨著細胞周期變化周而復(fù)始的出現(xiàn)和消失，使得蛋白激酶的活性發(fā)生周期性變化[15- 16]。其中，細胞周期蛋白cyclinB1主要在G2期合成，M晚期降解，cyclinD1主要在G1期合成，離開G1期時降解，cyclinB1與cyclinD1的比值是G2/M期的標記物[11]，因此，本實驗通過檢測梗阻性腎損傷腎間質(zhì)纖維化模型cyclinB1/cyclinD1的比值發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組cyclinB1/cyclinD1的比值顯著升高，驗證了腎小管上皮細胞G2/M期阻滯參與了缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，缺氧能通過腎小管上皮細胞G2/M期阻滯參與腎間質(zhì)纖維化。

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(編輯：孫茂民)

Effect of G2/M phase arrest in renal tubular epithelial cells on hypoxia- induced renal interstitial fibrosis

LIU Ting1，DANG Yang- jie2，LIU Li- min1，ZHANG Lei1，F(xiàn)U Ai- ping1，ZHANG Yu- ming1， WU Di3，DU Rui4，SUN Shi- ren1

(1.StateKeyLaboratoryofCancerBiology,DepartmentofNephrology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&ShaanxiEngineeringResearchCenterforDentalMaterialsandAdvancedManufacture,DepartmentofAnesthesiology,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China; 3.CadetBrigade,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China; 4.DepartmentofRadiationOncology,NavyGeneralHospital,Beijing,100048,China)

Objective: To investigate the effect of G2/M phase arrest in renal tubular epithelial cells on hypoxia- induced renal interstitial fibrosis．Methods:Invitro, HK2 cells were subjected to hypoxia(1%O2) or normoxia(21%O2) for 24 and 48 hrs. We examined the cell cycle distribution of HK2 cells by flow cytometry, the expression of COL4A1 and α- SMA was detected by Western blot 48 hrs after hypoxia;We observed the pathological changes and renal tissue fibrosis degree by HE and Masson staining. The expression of α- SMA was detected by immunohistochemical staining in UUO model. Then we tested the protein level of HIF- 1α, cyclinB1and cyclinD1 by Western blot in UUO model. Results: Compared with normoxia group, hypoxia group showed a significant increase in the percentage of G2/M stage in HK2 cells(P<0.05). Hypoxia induced a significant increase of α- SMA and COL4A1 in protein level(P<0.05); Compared with the sham group, HE and Masson staining revealed the increased degree of renal tissue fibrosis and increased expression of α- SMA that was mainly expressed in interstitial; HIF- 1α and G2/M phase marker cyclinB1/cyclinD1 was increased in UUO model by Western blot. Conclusion: Chronic hypoxia induced renal interstitial fibrosis is associated with G2/M arrest in renal tubular epithelial cells.

hypoxia; G2/M arrest; renal tubular epithelial cell；renal interstitial fibrosis

2016- 11- 08

2017- 02- 22

國家自然科學(xué)基金面上項目(NO.81370789)

劉婷(1990-)，女，漢族，陜西楊凌示范區(qū)人，在讀碩士研究生，腎臟內(nèi)科，研究方向：腎臟纖維化。E- mail：408634060@qq.com

孫世仁 E- Mail:sunshiren@medmail.com.cn

劉婷,黨楊杰，劉利敏，等.腎小管上皮細胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2017，36(2):240- 245.

R692.2

A

1671- 6264(2017)02- 0240- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.022