王 歡，董 川，李 彬，王 偉，王 璞，馬 瓊，文艷華，劉云燕，馬保安

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科，陜西 西安 710038；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第941醫(yī)院，青海 西寧 810007)

我國(guó)高原地區(qū)有其獨(dú)特的地勢(shì)地貌和氣候特點(diǎn)，其中低壓低氧環(huán)境對(duì)人類的健康有一定影響，不僅可以直接影響機(jī)體功能狀態(tài)，而且在機(jī)體受負(fù)荷刺激后，不同的地理環(huán)境因其氣壓等差異將產(chǎn)生不同的效應(yīng)[1]，如呼吸加快、心率增快、紅細(xì)胞增多(血液黏滯性增加)等，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及認(rèn)知、記憶功能的減退，甚至發(fā)生高原相關(guān)疾病[2-6]。骨質(zhì)疏松癥是一種多因素造成的慢性疾病[7-8]。目前的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高原地區(qū)人群骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率顯著高于平原地區(qū)，可能的影響因素包括氧氣濃度、日照、性別、年齡、體重、飲食習(xí)慣及基礎(chǔ)疾病等，其中氧氣濃度對(duì)于骨代謝的影響最為顯著[9-10]。高原低氧環(huán)境是否對(duì)骨組織有明確的影響，目前仍存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)觀察低氧與常氧環(huán)境中小鼠骨組織發(fā)生及發(fā)展是否存在差異，以及復(fù)氧能否改善低氧對(duì)骨組織的不良影響，進(jìn)一步明確缺氧與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性C57小鼠40只，體重16.5～24 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(陜)2020-007。隨機(jī)分為常氧組(16只)、低氧組(16只)、及低氧轉(zhuǎn)常氧組(8只)。分籠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物房及低壓低氧艙，每籠4只，自由攝食、飲水，溫度22～26 ℃，濕度55%～65%，光照時(shí)間按照12 h間隔。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備和軟件 低壓低氧模擬實(shí)驗(yàn)艙(中國(guó)貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)；SysmexXE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本SYSME東亞公司)；Micro-CT(GE)；生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(西安交通大學(xué)航空航天工程學(xué)院機(jī)械結(jié)構(gòu)強(qiáng)度與振動(dòng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；圖形分析軟件(美國(guó)Autodesk公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；復(fù)合光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympas公司)。

1.3 動(dòng)物模型制作及實(shí)驗(yàn)流程 常氧組和低氧組分別飼養(yǎng)于常氧和低氧環(huán)境8周，而低氧轉(zhuǎn)常氧組于低氧環(huán)境飼養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)至常氧環(huán)境飼養(yǎng)4周。三組小鼠前3 d分別置于動(dòng)物飼養(yǎng)室及低壓低氧艙(正常大氣壓)內(nèi)喂養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境。第4天開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，低壓低氧艙開(kāi)始降壓，艙內(nèi)空氣壓力設(shè)置為61.64 kPa，模擬海拔4000 m的大氣壓，氧分壓12.91 kPa，定期開(kāi)倉(cāng)投喂。常氧組仍于動(dòng)物房?jī)?nèi)正常大氣壓下喂養(yǎng)。于4周和8周行心尖取血后將雙側(cè)股骨分離取出，右側(cè)先后行micro-CT及HE染色，左側(cè)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。

1.4 血液學(xué)檢查 小鼠麻醉后由低壓低氧艙和動(dòng)物飼養(yǎng)房移至手術(shù)室在心尖取血，標(biāo)本收集后立即送至西京醫(yī)院門診檢驗(yàn)科檢測(cè)血常規(guī)。

1.5 micro-CT檢測(cè) 小鼠斷頸處死后，取右側(cè)股骨置于福爾馬林溶液中-4 ℃保存。標(biāo)本收集后統(tǒng)一行micro-CT檢測(cè)[11-12]。掃描參數(shù)：分辨率8 μm，球管電流80 mA，球管電壓80 kV，曝光時(shí)間3000 ms。掃描完成后，選取距離股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板1 mm處開(kāi)始向近端高度2 mm范圍為感興趣區(qū)域行三維重建，使用Explore Reconstruction軟件進(jìn)行重建定量分析[13]，檢測(cè)相對(duì)骨體積(BV/TV)、相對(duì)骨表面積(BS/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)[10]。

1.6 組織學(xué)觀察 將多聚甲醛固定后的右側(cè)股骨標(biāo)本流水沖洗24 h，經(jīng)10% EDTA脫鈣14 d，常規(guī)逐級(jí)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟浸潤(rùn)及包埋。用切片機(jī)5 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，HE染色，光鏡下觀察骨小梁分布以及面積、長(zhǎng)度、厚度等[14]。

1.7 生物力學(xué)檢測(cè) 將在70%濕鹽水中保存的左側(cè)股骨用紗布擦干水分[15]。將股骨標(biāo)本放置在生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上，實(shí)驗(yàn)臺(tái)跨距6 mm，加載速率0.005 mm/s。在加載負(fù)荷過(guò)程中，機(jī)器實(shí)時(shí)記錄下載荷與位移參數(shù)，直到股骨發(fā)生斷裂。比較兩組生物力學(xué)性能[16-17]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較用方差分析，三組間兩兩比較采用Newman-Keuls法(q檢驗(yàn))， 多樣本間兩兩比較涉及重復(fù)測(cè)量時(shí)用Bonferroni校正。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠體重及體重增量比較 見(jiàn)表1。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。4周時(shí)低氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組小鼠體重及體重增量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，但均低于常氧組(均P<0.05)。8周時(shí)三組小鼠體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組體重增量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但均高于低氧組(均P<0.05)。

表1 各組小鼠體重及體重增量比較(g)

2.2 三組小鼠血常規(guī)比較 見(jiàn)表2。4周時(shí)，低氧組紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)及紅細(xì)胞壓積(HCT)均高于常氧組(均P<0.05)。8周時(shí)，低氧組RBC、Hb、HCT均高于常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組(均P<0.05)，而常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組上述指標(biāo)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表2 三組小鼠血常規(guī)比較

2.3 三組小鼠4周及8周時(shí)微觀結(jié)構(gòu)比較 見(jiàn)表3(圖1)。micro-CT三維重建結(jié)果顯示，4周時(shí)低氧組骨小梁出現(xiàn)斷裂、變短、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化，空隙較大；常氧組骨小梁較粗，空隙較小，數(shù)量較多，連續(xù)性較好。8周時(shí)低氧組骨小梁斷裂、退化明顯，空隙明顯；低氧轉(zhuǎn)常氧組骨小梁空隙小且均勻，連續(xù)性較好。各參數(shù)量化分析結(jié)果顯示，4周時(shí)低氧組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧組，BS/TV高于常氧組(均P<0.05)；8周時(shí)低氧組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組，BS/TV高于常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組(均P<0.05)，而常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表3 三組小鼠4周及8周時(shí)微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

圖1 各組小鼠股骨干骺段4周(A)及8周(B)時(shí)二維平面及三維重建圖

2.4 三組小鼠股骨遠(yuǎn)端HE染色結(jié)果比較 見(jiàn)圖2。標(biāo)本均選擇股骨遠(yuǎn)端靠近生長(zhǎng)板處的松質(zhì)骨進(jìn)行觀察。4周時(shí)，可見(jiàn)低氧組骨小梁相對(duì)稀疏，常氧組骨小梁較為豐富。8周時(shí)，低氧組較常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組明顯疏松，但常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組無(wú)明顯差異。

圖2 三組小鼠股骨遠(yuǎn)端4周(A)、8周(B)時(shí)HE染色結(jié)果

2.5 三組小鼠4周及8周時(shí)生物力學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表4。4周時(shí)，低氧組股骨干最大力、剛度、最大應(yīng)力以及楊氏模量均低于常氧組(均P<0.05)。8周時(shí)，低氧組股骨干最大力、剛度、最大應(yīng)力以及楊氏模量均低于常氧組和低氧轉(zhuǎn)常氧組(均P<0.05)，但常氧組與低氧轉(zhuǎn)常氧組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表4 三組小鼠4周及8周時(shí)生物力學(xué)指標(biāo)比較

3 討 論

高原環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的復(fù)合環(huán)境，其中低大氣壓、低氧、低溫、低濕、強(qiáng)太陽(yáng)輻射等因素往往綜合作用于人體，對(duì)身體機(jī)能、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、大腦功能(記憶和認(rèn)知)等有明顯的影響。目前認(rèn)為低壓低氧是其中重要且對(duì)機(jī)體影響較大的因素[18-19]，對(duì)骨發(fā)生及骨愈合的影響也不乏報(bào)道。

本研究著重觀察高原低壓低氧環(huán)境對(duì)小鼠正常骨發(fā)生、發(fā)展的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠在缺氧環(huán)境較常氧環(huán)境中增長(zhǎng)緩慢，紅細(xì)胞增多(血液黏滯性增加)，符合高原缺氧環(huán)境的表現(xiàn)。較低的體重被認(rèn)為是降低氧耗量的適應(yīng)性改變，而增多的紅細(xì)胞從另一方面增加了血液的攜氧能力，從而保證機(jī)體更好地適應(yīng)低氧環(huán)境，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[20-22]一致。低氧環(huán)境小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨較常氧環(huán)境骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量顯著減少，骨表面積和組織體積比顯著增加，說(shuō)明低氧環(huán)境中正常骨組織發(fā)生了微觀結(jié)構(gòu)的改變，出現(xiàn)了骨質(zhì)流失，傾向于發(fā)生骨質(zhì)疏松，從而增加了發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)。生物力學(xué)測(cè)試則說(shuō)明了低氧環(huán)境中小鼠骨骼機(jī)械性能同時(shí)受損，其產(chǎn)生可能涉及多種機(jī)制。骨組織的正常發(fā)生、發(fā)展有賴于正常氧分壓下的局部微環(huán)境，當(dāng)體內(nèi)組織氧分壓下降，組織內(nèi)的血管形成及細(xì)胞外基質(zhì)沉積均會(huì)減弱，往往會(huì)影響骨組織的強(qiáng)度和質(zhì)量。特別重要的是，低氧環(huán)境中的小鼠復(fù)氧后表現(xiàn)出了骨骼結(jié)構(gòu)和功能的改善和恢復(fù)，與常氧環(huán)境無(wú)顯著差異，說(shuō)明骨組織的發(fā)展很大程度上依賴于骨組織局部微環(huán)境中的氧分壓，而氧分壓的改變會(huì)影響多種骨細(xì)胞的相互作用，宏觀上表現(xiàn)為骨組織結(jié)構(gòu)功能的改變。本研究選取小鼠股骨進(jìn)行了micro-CT、HE染色和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)等，結(jié)果提示在模擬高原低壓低氧的環(huán)境下小鼠正常骨組織的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀功能受到不同程度的影響，存在發(fā)展為骨質(zhì)疏松的可能性，其產(chǎn)生可能涉及多種機(jī)制，復(fù)氧對(duì)骨骼結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)具有一定作用。

骨的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓腔內(nèi)微環(huán)境共同完成。低氧環(huán)境下人體血氧濃度下降，骨髓腔內(nèi)氧濃度也受到明顯影響。在此微環(huán)境的變化下，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的代謝必然受到影響[23-25]。低氧環(huán)境下各種細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)的釋放打破了成骨與破骨的動(dòng)態(tài)平衡，綜合因素下造成骨質(zhì)流失[26-27]。本研究還發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)短期低氧環(huán)境已造成骨流失的情況下，復(fù)氧對(duì)于骨組織恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和功能尤為重要。因此，對(duì)于高原短期工作或任務(wù)人群，制定合理的高原環(huán)境中作業(yè)時(shí)間并及時(shí)有效地降高復(fù)氧對(duì)維持骨組織正常的平衡和保護(hù)原有的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。