趙 健，牛森森，周玉保，Muhammad Ayyub(巴基斯坦)

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 安徽 合肥 230601)

我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在全部惡性腫瘤中均位居第5位[1]。由于結(jié)直腸癌早期癥狀和體征不典型，現(xiàn)有早期診斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)等技術(shù)的敏感性和特異性仍不足，導(dǎo)致發(fā)病率和病死率居高不下，甚至出現(xiàn)上升趨勢(shì)[2-4]。結(jié)直腸腺瘤是目前公認(rèn)的具有不同程度異型增生的結(jié)直腸癌癌前病變，大部分結(jié)直腸癌被認(rèn)為起源于良性的結(jié)直腸腺瘤[5]。目前對(duì)結(jié)直腸腺瘤的病理診斷主要依據(jù)組織的顯微鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，帶有一定主觀性，難以準(zhǔn)確描述腺瘤的病理學(xué)特征和判斷其生物學(xué)行為，不利于結(jié)直腸腫瘤治療的及時(shí)性和有效性。近年來(lái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29(Endoplasmic reticulum protein 29，ERp29)在多種惡性腫瘤中的生物學(xué)行為調(diào)控作用已經(jīng)得到充分重視，研究[6]證實(shí)ERp29的異常表達(dá)會(huì)使相關(guān)蛋白失去執(zhí)行其正常功能的能力，從而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。然而，ERp29在結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展中扮演的角色尚有爭(zhēng)議，確切的調(diào)控作用和分子機(jī)制也不清楚。到目前為止，ERp29在結(jié)直腸腺瘤中未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法對(duì)比ERp29在結(jié)直腸組織癌變不同階段組織中的表達(dá)情況，以驗(yàn)證其在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的確切作用，為ERp29在結(jié)直腸腫瘤中的研究提供補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2018年6月至2019年12月行腸鏡下息肉切除的結(jié)直腸腺瘤組織60例(管狀腺瘤、絨毛狀管狀腺瘤及絨毛狀腺瘤組織各20例)，其中男性34例，女性26例，年齡40～77歲，平均年齡(61.67±10.13)歲。收集行外科手術(shù)治療的結(jié)直腸癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織各40例，其中男性22例，女性18例；年齡43～81歲，平均(62.45±11.61)歲。取同期行腸鏡下切除的非腺瘤性息肉組織20例作為腺瘤對(duì)照，其中男性10例，女性10例；年齡36～81歲，平均(58.95±10.96)歲。各組在性別、年齡構(gòu)成等常規(guī)資料比較上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。所有標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。排除術(shù)前接受過放化療的結(jié)直腸癌患者。

1.2 染色方法 ERp29采用EnVision法進(jìn)行染色。由我院病理科調(diào)取所需石蠟組織塊，切成4 μm厚度，60 ℃烤片4 h后備用。切片常規(guī)脫蠟、水化，依次為二甲苯10 min×3次、無(wú)水乙醇3 min×3次、95%乙醇3 min×2次、75%乙醇3 min×2次，蒸餾水沖洗1 min，置于PBS緩沖液中。枸櫞酸鹽緩沖液經(jīng)高壓鍋煮沸抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10 min后加入ERp29抗體(工作濃度1∶ 200)，37 ℃孵育60 min。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育20 min，DAB顯色，室溫孵育，自來(lái)水沖洗隨時(shí)終止顯色，蘇木精復(fù)染20 s，分化、沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為ERp29陽(yáng)性表達(dá)。在雙盲條件下，由2名高年資病理醫(yī)師在200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)清晰無(wú)折疊視野，分別從染色強(qiáng)度評(píng)分(0～3分)和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評(píng)分(0～4分)進(jìn)行評(píng)定并取平均值，通過兩種評(píng)分乘積判斷ERp29表達(dá)程度，得分越高則表達(dá)程度越高。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：①染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色記為0分，輕度染色記為1分，中度染色記為2分，重度染色記為3分。②陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞<5%記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分?！?分判定為陰性(-)，2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中等陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()，其中>2分判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，通過χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析結(jié)直腸腫瘤組織中ERp29表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，通過兩樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較ERp29表達(dá)程度與結(jié)直腸不同類型病變組織之間的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)情況比較 見表1(圖1)。免疫組化染色結(jié)果顯示，ERp29在結(jié)直腸良性病變及癌旁組織中多呈強(qiáng)陽(yáng)性或中等陽(yáng)性表達(dá)，在腺癌中多呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。結(jié)直腸腺癌組織ERp29陽(yáng)性率明顯低于其癌旁組織、腺瘤組織和非腺瘤組織(χ2=10.208、16.407、12.377，均P<0.01)。腺瘤和非腺瘤組織間ERp29表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)情況比較[例(%)]

A：非腺瘤性息肉組織；B：腺瘤組織；C：癌旁組織；D：腺癌組織

2.2 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)強(qiáng)度比較 見表2。結(jié)直腸腺癌組織ERp29表達(dá)強(qiáng)度顯著低于其癌旁組織、腺瘤組織和非腺瘤性息肉組織(Zc=-4.540、-5.562、-5.349，均P<0.01)。腺瘤組織ERp29表達(dá)強(qiáng)度低于非腺瘤性息肉組織(Zc=-2.177，P<0.05)。

表2 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)強(qiáng)度情況(例)

2.3 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理參數(shù)關(guān)系 見表3。通過卡方檢驗(yàn)對(duì)比結(jié)直腸癌組織不同臨床病理特征時(shí)ERp29表達(dá)陽(yáng)性率的差異，可知ERp29表達(dá)水平與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(均P<0.01)，而與腺癌患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度(T分期)及有無(wú)癌栓無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)。

表3 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理參數(shù)關(guān)系[例(%)]

2.4 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤組織學(xué)類型和異型增生程度關(guān)系 見表4。絨毛狀腺瘤組織ERp29陽(yáng)性率(70%)低于管狀腺瘤(90%)和絨毛狀管狀腺瘤(85%)，腺瘤伴重度異型增生組織ERp29陽(yáng)性率(66.7%)低于輕中度異型增生組織(85.4%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤組織學(xué)類型和異型增生程度關(guān)系[例(%)]

3 討 論

ERp29是一種分子量為29 kDa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，在真核生物多種組織中表達(dá)廣泛，尤其在分泌性組織中有著高水平的表達(dá)[7]。ERp29和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶樣蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上具有許多相似性，充當(dāng)分子伴侶協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中某些特定蛋白質(zhì)早期分泌途徑中的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，并參與真核生物多種重要生命進(jìn)程[8]。ERp29已被證實(shí)在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，目前大多數(shù)研究[9-12]顯示ERp29在各類惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展中扮演著抑癌因子的角色，然而另一些研究[13-14]發(fā)現(xiàn)ERp29同樣高表達(dá)于某些原發(fā)腫瘤及癌細(xì)胞株。

在對(duì)結(jié)直腸癌的研究中，Deng等[15]證實(shí)高表達(dá)的ERp29是導(dǎo)致結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移癌干細(xì)胞樣細(xì)胞侵襲能力的先天因素，并可對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層。Guo等[16]在對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)模型研究中發(fā)現(xiàn)ERp29表達(dá)上調(diào)，并通過與CUL5偶聯(lián)在ERS期間逆轉(zhuǎn)了ERS誘導(dǎo)的從間充質(zhì)樣到上皮樣表型的轉(zhuǎn)變(MET)過程，使癌細(xì)胞在遇到不利應(yīng)激時(shí)也能夠維持惡性生物活性，暗示ERp29高表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良相關(guān)，而這與檀祝利等[17]的研究結(jié)果相反。

綜上可見，ERp29的表達(dá)和作用可能受不同腫瘤組織類型、不同狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響而存在差異?；贓Rp29在結(jié)直腸癌研究中出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果，為探究ERp29在結(jié)直腸腫瘤中的確切作用，本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了結(jié)直腸不同類型病變組織中ERp29的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ERp29在各個(gè)類型組織中均有不同程度表達(dá)，非腺瘤、腺瘤及癌旁組織中ERp29多呈強(qiáng)陽(yáng)性或中等陽(yáng)性表達(dá)，腺癌中多呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。腺癌組織中ERp29表達(dá)陽(yáng)性率均顯著低于其他3種類型組織，雖然在非腺瘤性息肉和腺瘤組織中ERp29表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在ERp29表達(dá)強(qiáng)度的比較中非腺瘤組織比腺瘤組織有著更高程度的表達(dá)，提示在非腫瘤至良性腫瘤再至癌的續(xù)變過程中ERp29表達(dá)減少可能是結(jié)直腸腺瘤癌變的重要分子事件，其表達(dá)下調(diào)貫穿于整個(gè)腺瘤癌變進(jìn)程的各個(gè)階段。

在對(duì)結(jié)直腸腺瘤的研究中，本研究證實(shí)ERp29陽(yáng)性表達(dá)率在不同腺瘤組織學(xué)類型以及異型增生程度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但隨著腺瘤絨毛成分和異型增生程度的增加，ERp29陽(yáng)性表達(dá)率有逐漸降低趨勢(shì)，提示ERp29異常表達(dá)可能與腺瘤惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。Wu等[18]通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERp29可抑制胃癌細(xì)胞增殖，進(jìn)一步的機(jī)制研究表明ERp29可通過阻斷PI3K/AKT通路/GSK-3β或AKT-mTOR信號(hào)抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程[19]。Bambang等[20-21]在對(duì)乳腺癌細(xì)胞中ERp29相關(guān)作用的研究中還證實(shí)了ERp29通過使β-catenin易位抑制活化的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，在緊密連接和細(xì)胞極性恢復(fù)以及通過建立細(xì)胞-細(xì)胞接觸在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MET中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果也間接提示ERp29有抑制結(jié)直腸黏膜組織細(xì)胞異常增殖的作用，可能與上述作用機(jī)制相關(guān)。在ERp29表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究中，本研究結(jié)果也與檀祝利等[17]研究結(jié)果基本一致，并且發(fā)現(xiàn)較大的腫瘤直徑、較低的細(xì)胞分化程度、更深的浸潤(rùn)深度和癌栓存在使得ERp29的表達(dá)有逐漸降低的趨勢(shì)，雖然它們未顯示出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但考慮到免疫組化檢測(cè)的特異性和靈敏度相對(duì)不足，仍在一定程度上提示ERp29異常表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的惡性行為有關(guān)。

總之，本研究證實(shí)ERp29作為一種抑癌因子參與了結(jié)直腸從非腫瘤至良性腫瘤再至癌的序列演變過程的各個(gè)階段?？梢酝茰y(cè)，ERp29可能是一個(gè)更有效的分子生物學(xué)標(biāo)志物，在結(jié)直腸腺瘤早期癌變傾向和程度的監(jiān)測(cè)以及結(jié)直腸腺癌轉(zhuǎn)移傾向的評(píng)估中有潛在應(yīng)用價(jià)值，并在作為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)方面也具有一定的研究?jī)r(jià)值。