顧磊

[摘要] 目的 觀察裸角質(zhì)膜同源蛋白（NKD1）、β-連環(huán)素（β-catenin）和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，探討其在結(jié)直腸癌變過程中的意義。 方法 收集2014年1月～2016年1月在鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（我院）行結(jié)直腸癌根治術(shù)切除的癌癥組織96例及27例腸管正常黏膜，并收集同期在我院治療的38例結(jié)直腸腺瘤切除標(biāo)本，采用SP免疫組化法對所有標(biāo)本中NKD1、β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，分析NKD1陽性率、Cyclin D1陽性率與β-catenin異位表達(dá)率三者之間的相關(guān)性。 結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中NKD1的陽性率（17.71%）明顯低于結(jié)直腸正常黏膜（92.59%）及腺瘤組織（78.95%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）；結(jié)直腸癌組織中的β-catenin異位表達(dá)率（78.13%）和Cyclin D1陽性率（84.38%）均明顯高于結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤組織中的表達(dá)率（42.11%、34.21%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）；NKD1、β-catenin和Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)均與癌分化程度、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 NKD1、β-catenin和Cyclin D1可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測可判斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為并作為臨床治療的參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；裸角質(zhì)膜同源蛋白；β-連環(huán)素；細(xì)胞周期蛋白D1

[中圖分類號] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（b）-0115-04

Expression and significance of NKD1， β-catenin and Cyclin D1 in colorectal cancer

GU Lei

Department of Pathology， Huangshi Central Hospital of Edong Healthcare Group Affiliated Hospital Hubei Polytechnic University， Hubei Province， Huangshi 435000， China

[Abstract] Objective To observe the expression of naked cutin membrane homologous protein （NKD1）， β serial element （β- catenin） and cell cycle protein D1 （Cyclin D1） in colorectal cancer tissues and explore its significance in the process of colorectal cancer. Methods 96 cases of colorectal cancer and intestinal resection of the cancer tissue margin of normal mucosa in 27 cases， 38 cases of colorectal adenoma resection specimens in Huangshi Central Hospital of Edong Healthcare Group from January 2014 to January 2016 were collected. SP immunohistochemical method was used to detect the expression of NKD1， beta -catenin and Cyclin D1 in all specimens. The correlation between NKD1 positive rate， Cyclin D1 positive rate and ectopic expression rate of -catenin was analyzed. Results The positive rate of NKD1 in colorectal cancer tissues （17.71%） was significantly lower than that in normal colorectal mucosa and adenoma respectively （92.59%， 78.95%）， the differences were statistically significant （P < 0.05）； β-catenin protein expression in colorectal cancer tissues （78.13%） and the rate of Cyclin D1 positive rate （84.38%） was significantly higher than that of normal colorectal mucosa， adenoma tissues respectively （42.11%， 34.21%）， the differences were statistically significant （P < 0.05）； the expression of NKD1， β -catenin and Cyclin D1 in colorectal cancer tissues was related to the differentiation degree， Duke stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. Conclusion NKD1， β-catenin and Cyclin D1 may be involved in the occurrence， development， invasion and metastasis of colorectal cancer， and the combined detection of the biological behavior of colorectal cancer can be used as a reference for clinical treatment.

[Key words] Colorectal cancer； NKD1； β-catenin ； Cyclin D1

結(jié)直腸癌是臨床常見惡性腫瘤，在我國具有較高的發(fā)病率和死亡率。研究表明，Wnt信號通路異?；罨c結(jié)直腸癌病變存在緊密關(guān)系[1]。裸角質(zhì)膜同源蛋白（NKD1）、β-連環(huán)素（β-catenin）和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是Wnt信號通路的重要因子，Wnt異常激活會導(dǎo)致β-catenin異位表達(dá)，并在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)聚集；NKD1是Wnt信號通路上的重要抑制因子，具有抑制其活化的作用；Cyclin D1則是Wnt信號通路的下游靶基因，具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用[2-3]。本研究采用免疫組化SP法檢測NKD1、β-catenin和Cyclin D1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，探討其在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中的作用，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年1月在鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行結(jié)直腸癌根治術(shù)切除的癌癥組織標(biāo)本96例作為癌癥組，所有患者術(shù)前均未行放化療，其中男51例，女45例，平均年齡（51.69±8.32）歲，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期51例，Ⅲ+Ⅳ期45例；有淋巴轉(zhuǎn)移60例，無淋巴轉(zhuǎn)移36例。結(jié)直腸腺瘤患者切除腺瘤標(biāo)本38例作為腺瘤組，其中男26例，女12例，平均年齡（50.37±8.28）歲；并從結(jié)直腸癌患者中選取27例腸管正常黏膜（距離癌灶>10 cm）作為正常組，其中男14例，女13例，平均年齡（51.19±8.17）歲；所有標(biāo)本均經(jīng)高年資病理診斷醫(yī)師確定診斷。癌癥組、腺瘤組、正常組患者的性別、年齡一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情并簽署同意書。

1.2 檢測試劑及方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人NKD1多克隆抗體由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)；鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體、SP兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒均由北京中杉金橋公司生產(chǎn)。

1.2.2 檢測方法 所有標(biāo)本采用10%福爾馬林溶液充分浸泡、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟、水化，采用枸櫞酸鹽緩沖液微波處理進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉30 min 后分別滴加兔抗人NKD1多克隆抗體（1∶50稀釋）、鼠抗人β-catenin單克隆抗體（1∶200稀釋）、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體（1∶200稀釋），4℃孵育過夜，其余步驟嚴(yán)格按照即用型SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，DAB著色、蘇木精復(fù)染，中性樹脂封閉保存[4-7]。陰性對照由美國Santa Cruz公司及北京中杉金橋公司提供，陽性對照采用已知結(jié)直腸癌陽性組織。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 NKD1陽性判讀標(biāo)準(zhǔn) NKD1陽性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大小不一的棕黃色或棕褐色顆粒[8-9]。檢驗結(jié)果需要參考染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比兩個指標(biāo)。染色強(qiáng)度評分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色強(qiáng)度分為無色、淺棕色、棕黃色、棕褐色，分別對應(yīng)0～3分。高倍鏡下（400×）隨機(jī)取5個不同視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞比例≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。將兩項評分相乘所得結(jié)果如>3分，則判定NKD1為陽性。

1.3.2 β-catenin異位表達(dá)判讀標(biāo)準(zhǔn) β-catenin主要存在于黏膜上皮細(xì)胞膜，如出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中則為異位表達(dá)[10-11]。在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)以10%作為標(biāo)準(zhǔn)，如>10%則細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)異位表達(dá)，≤10%則為正常，每張切片任意選取10個高倍視野（400×），分別計數(shù)100個細(xì)胞。

1.3.3 Cyclin D1陽性判讀標(biāo)準(zhǔn) Cyclin D1陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)大小不一的棕黃色或棕褐色顆粒[12-13]。檢驗結(jié)果需要參考染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比兩個指標(biāo)。染色強(qiáng)度評分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色強(qiáng)度分為無色、淺棕色、棕黃色、棕褐色，分別對應(yīng)0～3分。高倍鏡下（400×）隨機(jī)取5個不同視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞比例≤10%為0分，陽性細(xì)胞比例>10%～45%為1分，>45%～70%為2分，>70%為3分。將兩項評分相乘所得結(jié)果如>3分，則判定Cyclin D1為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用百分比，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NKD1、β-catenin和Cyclin D1在不同組別組織中的表達(dá)情況

NKD1在正常組織、腺瘤組織、癌癥組織中的陽性表達(dá)率依次降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），但正常組與腺瘤組之間的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；β-catenin和Cyclin D1在正常組織、腺瘤組織、癌癥組織中的陽性表達(dá)率依次上升，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 NKD1、β-catenin和Cyclin D1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸腺癌組織中的NKD1陽性表達(dá)、β-catenin異位表達(dá)和Cyclin D1陽性表達(dá)與腫瘤TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P < 0.05），與性別、年齡、腫瘤直徑、病變部位等因素?zé)o關(guān)（P > 0.05）。見表2。

2.3 NKD1、β-catenin和Cyclin D1之間的相關(guān)性

在結(jié)直腸腺癌組織中NKD1的陽性率和β-catenin異位表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.546，P < 0.05）；β-catenin異位表達(dá)率與Cyclin D1陽性率呈正相關(guān)（r=0.672，P < 0.05）；NKD1的陽性率和Cyclin D1陽性率無相關(guān)性（r=0.013，P > 0.05）。

3 討論

NKD1是Wnt信號通路上重要的抑制蛋白，普遍存在于正常組織中，與多種腫瘤存在密切關(guān)系。NKD1中的活性結(jié)構(gòu)位點EF-Hand與Dvl的PDZ區(qū)域相結(jié)合，使得散亂蛋白含量降低，抑制了經(jīng)典Wnt/β-catenin信號途徑激活[14]。同時NKD1還可以激活c-JNK調(diào)節(jié)Wnt/PCP信號通路，從而影響上皮細(xì)胞的積極性，調(diào)節(jié)黏附蛋白的活動，最終抑制腫瘤的增殖[12]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中的NDK1陽性表達(dá)率明顯低于正常組織和腺瘤組織，使其無法抑制Wnt通路激活，導(dǎo)致β-catenin進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，促使腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[15]。本研究結(jié)果表明，NDK1與腫瘤的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

β-catenin蛋白在Wnt信號通路中具有激活通路和抑制癌細(xì)胞侵襲的雙重作用。正常細(xì)胞中的β-catenin蛋白與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白、軸蛋白結(jié)合，形成降解復(fù)合物，而很少進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中[16]。但是當(dāng)Wnt異常被激活時，β-catenin蛋白的降解過程會受到抑制，β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞中，與TCF/LEF結(jié)合成復(fù)合體，并激活通路下游的靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，從而導(dǎo)致癌變[17]。β-catenin與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白結(jié)合，能夠維持細(xì)胞黏附，當(dāng)β-catenin減少時，這種黏附作用降低，導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)，加快了癌細(xì)胞擴(kuò)散。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中的β-catenin異常表達(dá)率明顯高于正常組織和腺瘤組織，且與腫瘤的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示β-catenin蛋白可能參與了結(jié)直腸癌的惡性表現(xiàn)，并促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和分化，可作為評估腫瘤預(yù)后的預(yù)測因素。

Cyclin D1蛋白是周期素蛋白家族的重要成員，其重要功能就是促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過激活依賴性激酶CDK4，使得G1期周期抑制蛋白（Rb）被磷酸化，CDK4對Rb蛋白調(diào)節(jié)失常，導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長，從而使得細(xì)胞周期由G1期加速進(jìn)入S期[18]。本研究結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌組織的Cyclin D1陽性率明顯高于正常組織和結(jié)直腸腺瘤組織，與任斐等[19]的研究結(jié)果一致。同時，結(jié)直腸癌組織中的Cyclin D1蛋白陽性率與腫瘤的TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

NKD1、β-catenin和Cyclin D1三種Wnt信號通路的成員蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中相互作用[20]。本研究結(jié)果表明，NKD1與β-catenin呈負(fù)相關(guān)，NDK1可以阻止β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)積聚，從而影響β-catenin表達(dá)，維持通路中各分子平衡。β-catenin與Cyclin D1呈正相關(guān)，β-catenin異位表達(dá)率升高時，導(dǎo)致受β-catenin調(diào)控的核內(nèi)癌基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，同時Cyclin D1的陽性表達(dá)率升高。

綜上所述，NKD1的失表達(dá)、β-catenin異位表達(dá)和Cyclin D1的高表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中同時存在，并均與腫瘤的TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此聯(lián)合檢測NKD1、β-catenin和Cyclin D1對于判斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為，預(yù)測癌癥發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定的臨床價值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 姜濤，吳淑華，何雙，等.大腸癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中PI3Kp110、PI3Kp110與Bcl-2、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性及其意義[J].世界華人消化雜志，2015，23（20）：3226-3234.

[2] Stanczak A，Stec R，Bodnar L，et al. Prognostic significance of Wnt-1，β-catenin and E-cadherin expression in advanced colorectal carcinoma [J]. Pathol Oncol Res，2011，17（4）：955-963.

[3] Nallet-Staub F，Marsaud V，Li L，et al. Pro-invasive activity ofthe Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma [J]. J Invest Dermatol，2014，134（1）：123-132.

[4] 吳健，范欽和.結(jié)直腸癌中TAZ和β-catenin 的表達(dá)及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2014，30（12）：1346-1349.

[5] 虞杰，干文娟，顧冬梅，等.結(jié)直腸癌組織中DPC4、CDK4 的表達(dá)及臨床意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2015，31（11）：1278-1280.

[6] 蔣雯娟，杜趙康，李正金，等.結(jié)直腸癌中NKD1和β-catenin的表達(dá)及意義[J].解剖學(xué)雜志，2016，39（2）：116-118.

[7] 李蓓蓓，李亞玲，王學(xué)斌，等.雙腎上腺皮質(zhì)激素樣激酶-1與細(xì)胞周期蛋白D1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29（4）：381-384.

[8] 林山，蔣曉芳，王亞萍，等.NKD1和β-catenin 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥，2014，54（25）：38-40.

[9] 苗玉，周瑋瑋，張欣，等.Wnt信號通路成員蛋白NKD1、β-catenin和CyclinD1在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2016，32（2）：146-151.

[10] 宋騰騰，姜松梅，姜惠峰，等.E-cadherin、TGF-β和β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義[J].中國體視學(xué)與圖像分析，2014，19（1）：76-83.

[11] 趙一軍，石枕長，韓華中，等.β-catenin、E-cadherin和Ki67在小鼠大腸癌中的表達(dá)及其意義[J].中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2014，17（6）：430-434.

[12] 徐惠敏，曹紹歧.CyclinD1、p73 和p27 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].河北醫(yī)藥，2016，38（4）：499-501.

[13] 李素艷，黃杰安，譚林，等.NIK和IKKβ連接蛋白、C-myc和細(xì)胞周期蛋白D1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18（24）：2922-2928.

[14] Konsavage WM Jr， Kyler SL， Rennoll SA， et al. Wnt/β-catenin signaling regulates Yes-associated protein （YAP） gene expression in colorectal carcinoma cells [J]. J Biol Chem， 2012，287（15）：11730-11739.

[15] Thomson S，Petti F，Sujka-Kwok I，et al. A systems view of epithelial-mesenchymal transition signaling states [J]. Clin Exp Metastasis，2011，28（2）：137-155.

[16] Sheppard KE，McArthur GA. The cell-cycle regulator CDK4：anemerging therapeutic target in melanoma [J]. Clin Cancer Res，2013，9（19）：5320-5328.

[17] Shintani M，Sangawa A. Immunohistochemical expression of nuclear and cytoplasmic survivin in gastrointestinal carcinoma [J]. Int J Clin Exp Pathol，2013，6（12）：2919-2927.

[18] 郭存存，孫晉敏，韓文燦，等.結(jié)直腸癌中FOXO3a表達(dá)及其與β-catenin、E-cadherin關(guān)系[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29（7）：737-741.

[19] 任斐，任鴻.cyclin D1 和survivin 在大腸癌組織中的表達(dá)[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（3）：381-383.

[20] 朱鵬武，吳春松，鄭海紅.大腸癌組織中Sixl和CyclinD1的表達(dá)及其臨床意義[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2015，17（11）：1868-1886.

（收稿日期：2016-06-12 本文編輯：王紅雙）