王勤 肖喜泉 董威 唐慧勤 盧鳳來 李耀華 李典鵬 王劍 林吳

摘要： 為了研究羅漢果祛痰作用與活性成分的相關(guān)性，該研究首先測定了19批羅漢果提取物高效液相（HPLC）指紋圖譜和小鼠氣管酚紅排泌量，找出了指紋圖譜共有峰，采用灰色關(guān)聯(lián)度法確定各共有峰對祛痰效果貢獻(xiàn)度，利用偏最小二乘法（PLS）得出了各共有峰的正負(fù)相關(guān)及貢獻(xiàn)度。結(jié)果表明：共有峰為14個，其中關(guān)聯(lián)度在0.8以上的有12個峰（正相關(guān)峰為3、11、12、13號峰，負(fù)相關(guān)峰為1、2、4-10、14號峰）；11、12號峰分別為氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ。因此，羅漢果祛痰作用不是單一成分起作用，而是多種成分綜合作用的結(jié)果。其中，氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ有祛痰作用，貢獻(xiàn)率較大。

關(guān)鍵詞： 羅漢果， 祛痰作用， 譜效關(guān)系

中圖分類號： Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）05060604

Abstract： In order to investigate the relationship between expectorant efficacy and active components of Siraitia grosvenorii， the phenol red secretion of trachea in mice and the HPLC fingerprint of S. grosvenorii extract were determined. Grey relational analysis was applied to confirm the contribution degree of each common peak from HPLC fingerprints for expectoration efficacy， while partial leastsquares regression （PLS） was utilized to confirm either positive or negative relationship， and to identify the contribution degree of S. grosvenorii extract. The results indicated that fourteen common peaks were chosen in HPLC fingerprints， including twelve peaks with relation rate higher than 0.8 （No.3， 11， 12， 13 peaks were positive correlation peaks， and No.1， 2， 4-10， 14 peaks were negative correlation peaks）， No.11 and 12 peaks were Oxomogroside V and Mogroside V respectively. Therefore， expectorant efficacy of S. grosvenorii is contributed by a combined action of multicomponents rather than one component. Oxomogroside V and Mogroside V have an expectorant efficacy and high contribution degree.

Key words： Siraitia grosvenorii， expectorant efficacy， spectrumefficacy relationship

羅漢果（ Siraitia grosvenorii） 是廣西道地中藥材，具有止咳、祛痰、通便、解痙、保肝（王勤等，1999； 張宏等，2011）、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞（夏星等，2012； 何超文等，2012b） 等廣泛的藥理活性。而與藥理作用相關(guān)的活性成分大多指向羅漢果甜苷Ⅴ（王霆等，1999；劉婷等，2007），其他化學(xué)成分對藥理作用是否有貢獻(xiàn)，尚不明確。

2015年版《中華人民共和國藥典》中羅漢果的評價標(biāo)準(zhǔn)有定性鑒別及規(guī)定羅漢果皂苷Ⅴ的含量測定不得少于0.50%（國家藥典委員會，2015）?，F(xiàn)行的羅漢果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對保障羅漢果的基本質(zhì)量起了肯定的作用，但它忽略了中藥的藥效是多成分的協(xié)同作用，難以對其質(zhì)量進(jìn)行較全面的評價。而中藥譜效關(guān)系是將中藥的藥效與指紋圖譜很好地結(jié)合起來評價中藥內(nèi)在質(zhì)量及其成分與其活性間關(guān)系的新方法（國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會，1999）。本研究通過建立羅漢果指紋圖譜獲得化學(xué)數(shù)據(jù)，同時采用小鼠酚紅排泌法獲得祛痰藥效數(shù)據(jù)，運用灰度關(guān)聯(lián)法與最小偏二乘法將化學(xué)數(shù)據(jù)與藥效數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，建立羅漢果祛痰的譜效關(guān)系模型。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑羅漢果藥材19批，均為青皮果，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥物鑒定教研室田慧教授鑒定為羅漢果（Momordica grosvenori）的果實。藥材編號及產(chǎn)地：永福龍江（S1-11，育苗方式、采摘時間、果形大小等有差異，下同）、湖南衡陽（S12-13）、南寧壇洛（S14-15）、永福堡里（S16-17）、永福百壽（S18-19）。對照品羅漢果苷Ⅴ為本實驗小組自制，遠(yuǎn)志購自柳州市神農(nóng)中藥飲片廠，批號20130305。酚紅，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20130725。碳酸氫鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號：20130409。氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號：2013102101。分析純甲醇、乙醇、磷酸，廣東汕頭市西隴化工廠。色譜純乙腈，美國TEDIA公司。水為重蒸蒸餾水，自制。

1.1.2 儀器1100分析型高效液相色譜儀（包括二極管列陣多波長DVD檢測器、四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、7725i手動進(jìn)樣器、HP化學(xué)工作站），美國Agilent公司；B3500SMT超聲波清洗器，必能信超聲（上海）有限公司；雙光束紫外可見光光度計TU1901，北京普析通用儀器有限公司；L600臺式低速自動平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MATLAB R2013數(shù)學(xué)軟件，美國MathWorks公司。

1.1.3 動物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～24 g，廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。合格證號： SCXK桂2009-0002。

1.2 方法

1.2.1 羅漢果提取物制備稱取羅漢果藥材1 000 g，先后用10倍量、8倍量、5倍量的水提取，時間分別為1.5、1、1 h，合并濾液，加熱濃縮至1 000 mL，加入1倍量的95%乙醇，混勻，封口，-4 ℃靜置48 h，抽濾，得濾液回收乙醇濃縮成浸膏備用。

1.2.2 小鼠氣管酚紅法420只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為19個羅漢果組、空白組與陽性遠(yuǎn)志組，每組20只。Ig分別給予羅漢果提取物每公斤40 g生藥量（每公斤體重給羅漢果藥材量），純凈水與遠(yuǎn)志提取物20 g·kg1（每公斤體重給遠(yuǎn)志藥材量），給藥體積為0.2 mL·10 g1，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。第2天給藥后禁食不禁水10 h。末次給藥45 min后腹腔注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，15 min后悶死，用5% NaHCO3溶液1 mL灌洗呼吸道，重復(fù)3次，合并洗出液，離心，取上清液用紫外分光光度計（波長546 nm）比色。通過酚紅溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酚紅排泌量以及祛痰率。

祛痰率=（實驗組平均酚紅排泌量-空白組酚紅排泌量）/ 空白組酚紅排泌量

表1結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志組和19個羅漢果組對小鼠均有一定的祛痰作用。因此，對19批羅漢果提取物進(jìn)行小鼠祛痰作用的譜效關(guān)系研究。

1.2.3 羅漢果提取物的HPLC指紋圖譜

1.2.3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAXSBC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；流動相：0.05%磷酸（A）- 乙腈（B）（梯度洗脫：0～8 min，3%～13.5% B；8～35 min，13.5%～35%B；35～45 min：35% B）；檢測時間：45 min；流速：0.8 mL·min1；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL（盧風(fēng)來等，2010）。

1.2.3.2 對照品溶液制備稱取羅漢果苷Ⅴ、氧化羅漢果苷Ⅴ適量，用甲醇溶解到5 mL的容量瓶中，超聲使其充分溶解，并用甲醇定容至刻度，以0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。

1.2.3.3 供試品溶液制備取羅漢果浸膏2 g，精密稱量，置25 mL容量瓶中，加入純凈水定容至刻度，溶解，搖勻，以0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

1.2.3.4 HPLC圖譜峰的歸屬精密吸取羅漢果苷Ⅴ及氧化羅漢果苷Ⅴ對照品溶液以及19批羅漢果供試藥品溶液進(jìn)樣，按“2.3.1”項下色譜條件測定。19批羅漢果共確定有14個共有峰，其中11號和12號峰分別與對照品氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ的保留時間與紫外光譜圖相同，鑒定為氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ（圖1）。

2結(jié)果與分析

2.1 譜效關(guān)系的灰色關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)順序分析

將各共有峰原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換（即首先分別求出各個序列數(shù)據(jù)的平均值，再用平均值去除以對應(yīng)序列中的各個原始數(shù)據(jù)，所得到的商為新的數(shù)據(jù)列，即均值化數(shù)列，又叫規(guī)格化數(shù)據(jù)）。根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度分析法計算關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，各個共有峰所代表的化學(xué)成分與祛痰作用均具有一定的關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度>0.60），表明羅漢果提取物的祛痰作用是其多個化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。在羅漢果提取物HPLC指紋圖譜中，1-4號峰、6號峰以及8-14號峰所代表的化學(xué)成分與祛痰作用具有高度關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度>0.80）。依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，確定各成分（P）對祛痰作用貢獻(xiàn)大小順序為P11>P12>P1>P14>P8>P3>P13>P9>P6>P2>P4>P10>P7>P5。其中11號峰為氧化羅漢果苷Ⅴ，12號峰為羅漢果苷Ⅴ。

2.2 譜效關(guān)系的偏最小二乘法分析

使用MATLAB R2013軟件，依據(jù)偏最小二乘分析方法，計算出上述指紋圖譜中各個共有峰的峰面積與祛痰藥效間的數(shù)理關(guān)系。表2結(jié)果表明，根據(jù)19批羅漢果提取物的圖譜數(shù)據(jù)，得出各峰（P）對祛痰作用的貢獻(xiàn)大小依次為P12>P11>P13>P3>P4>P10>P8>P7>P1>P2>P9>P14>P5>P6，其中P12、P11、P13、P3與祛痰效果呈正相關(guān)，P4、P10、P8、P7、P1、P2、P9、P14、P5、P6與祛痰效果呈負(fù)相關(guān)。

3討論與結(jié)論

本研究使用經(jīng)典的酚紅排泌法來測定不同產(chǎn)地、不同采收期、不同加工方法的羅漢果共19批次的祛痰作用，結(jié)果羅漢果的祛痰作用明顯。同時使用HPLC建立了羅漢果提取物的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)了其中14個共有特征峰，并確定了其中2個指紋峰，分別為羅漢果苷Ⅴ與氧化羅漢果苷Ⅴ。用灰色關(guān)聯(lián)度法進(jìn)行譜效關(guān)系分析，結(jié)果表明在HPLC指紋圖譜中，P11、P12、P1、P14、P8與祛痰作用的關(guān)聯(lián)度較大，其中P11為氧化羅漢果苷Ⅴ，P12為羅漢果苷Ⅴ。王霆等（1999）報道羅漢果甜苷有祛痰作用，劉婷等（2007）也報道羅漢果皂苷Ⅴ有祛痰作用。本研究使用偏最小二乘法分析譜效關(guān)系，結(jié)果表明P12、P11、P13與祛痰作用呈正相關(guān)且貢獻(xiàn)較大，P1、P14、P8則呈負(fù)相關(guān)，提示羅漢果提取物的祛痰作用可能是多種成分共同作用的結(jié)果，這與我們的預(yù)期相符。而羅漢果苷Ⅴ是羅漢果甜苷主要組成成分之一，本研究結(jié)果提示羅漢果苷Ⅴ對祛痰作用的貢獻(xiàn)率較大，與王霆等（1999）和劉婷等（2007）的研究結(jié)果相吻合。

本研究中，由于通過質(zhì)譜技術(shù)和對照品等因素，除了P11和P12外，其他峰是何化學(xué)成分還無法鑒定。而將這些化合成分分離出來，采用波譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，并測定其藥理活性，將是本課題今后的研究方向之一。

參考文獻(xiàn)：

Chinese Pharmacopoeia Commission，2015. Pharmacopoeia of China： Vol. Ⅰ [M]. 2015 ed. Beijing： China Medical Science Press：197. [國家藥典委員會. 2015. 中華人民共和國藥典：一部 [M]. 2015年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社：197.]

Editorial Committee of Chinese Materia Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine， 1999. Chinese materia medica： Book Ⅱ [M]. Shanghai： Shanghai Scientific and Technical Publisher：4645-4647. [國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會， 1999. 中華本草第二冊 [M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社：4645-4647.]

LU FL， LIU JL， HUANG YL， et al， 2010. HPLC fingerprints of Siraitia grosvenorii at different growth states [J]. Food Sci， 31（18）：283-284. [盧鳳來，劉金磊，黃永林，等，2010. 不同生時期羅漢果高效液相指紋圖譜研究 [J]. 食品科學(xué)，31（18）：283-284.]

HE CW， XIA X， ZHU XY， et al， 2012. The antifatigue activity of fresh tissue culture seedling Grosvenor momordica fruit [J]. Food Sci Technol，37（8）： 75-78. [何超文，夏星，朱曉韻，等，2012. 組培苗鮮羅漢果抗疲勞活性研究 [J].食品科技：37（8）： 75-78.]

LIU T， WANG XH， LI C， et al， 2007. Study on the antitussive， expectorant and antispasmodic effects of mogrosides Ⅴ [J]. Chin J Pharm Sci，42（20）：1534-1536. [劉婷，王旭華，李春，等，2007. 羅漢果皂苷Ⅴ的鎮(zhèn)咳、祛痰及解痙作用研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志，42（20）：1534-1536.]

WANG T， HUANG ZJ， JIANG YM， et al， 1999. Study on the biological activity of mogrosides [J]. Chin Herb Med， 30（2）：914-916. [王霆，黃志江，蔣毅珉，等，1999. 羅漢果甜苷的生物活性研究 [J]. 中草藥，30（2）：914-916.]

WANG Q， LI AY， LI XP， et al， 1999. Pharmacologic action of Siraitia grosvenorii [J]. Chin J Chin Mat Med， 4（7）： 425-428. [王勤，李愛媛，李獻(xiàn)萍，等，1999. 羅漢果的藥理作用研究 [J]. 中國中藥雜志，24（7）：25-428.]

XIA X， ZHONG ZG， LIN CY， et al， 2012. Antifatigue and hypoxia tolerance effect of mogrosides in mice [J [. Chin J Experim Trad Med Form， 18（17）： 198-201. [夏星，鐘振國，林彩云，等，2012. 羅漢果皂苷抗疲勞及耐缺氧作用 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，18（17）：198-201.]

ZHANG H， LI XH， 2011. Research advance of pharmacological effects and toxicity of Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey [J]. Chin Agric Sci Bull， 27（5）： 430-433. [張宏，李嘯紅，2011. 羅漢果的藥理作用和毒性研究進(jìn)展 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，7（5）：430-433.]