向巧彥 黃夕洋 李虹 甘金佳 梁勇詩 蔣水元

摘要： 為探究太空環(huán)境對羅漢果造成的誘變效應，篩選羅漢果新品種培育優(yōu)異種質(zhì)，該研究運用ISSR分子標記技術，對28個航天誘變羅漢果及主栽品種進行了全基因組多態(tài)性檢測和聚類分析。結果表明：從100個ISSR引物中篩選得到17個引物，共擴增出157個條帶，其中83條具有多態(tài)性，多態(tài)條帶百分率為52.87%，遺傳相似系數(shù)范圍為0.707～0.987。根據(jù)UPGMA聚類圖，28個羅漢果樣本可以分為3類：聚類Ⅰ為航天種質(zhì)B6和B3♀；聚類Ⅱ為航天種質(zhì)A1♀、A14、A18與主栽品種；聚類Ⅲ中都為航天羅漢果種質(zhì)。上述結果暗示A1♀、A14、A18與其他航天種質(zhì)已經(jīng)產(chǎn)生了一定的遺傳分化，具有與主栽品種相似的遺傳背景，可能獲得了有益突變。該研究結果為羅漢果新品種培育和雜交親本選配提供了科學依據(jù)。

關鍵詞： 羅漢果， 空間誘變育種， ISSR， 分子標記輔助選擇

中圖分類號： Q949.9

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）05058107

Abstract： In order to investigate genetic variation of Siraitia grosvenorii after space flight， and to create elite germplasms， ISSR （intersimple sequence repeats） molecular markers were used to detect the genomewide DNA polymorphism and to make cluster analysis of 28 S. grosvenorii samples including spaceflight accessions and main cultivars. Seventeen primers which had clear polymorphic bands were selected from 100 primers. A total of 157 bands were detected， of which 83 bands were polymorphic with a polymorphic rate of 52.87%. Genetic similarity coefficient ranged from 0.707 to 0.987. UPGMA cluster analysis revealed that 28 samples formed three primary distinct clusters： Cluster I included two space mutation germplasms B6 and B3♀； Cluster Ⅱ contained space mutation germplasm A1♀， A14， A18 and all the main cultivars； The remaining space mutation germplasm belonged to cluster Ⅲ. These results were as follows： （1） Space mutation could result in genetic variation of S. grosvenorii. （2） A1♀， A14 and A18 might gain positive mutation because their genetic backgrounds were similar with the main cultivars， which could provide useful information for creating new elite germplasms in S. grosvenorii.

Key words： Siraitia grosvenorii， space mutation breeding， ISSR， molecular markerassisted selection

羅漢果（Siraitia grosvenorii ）是我國特有的葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，以果實入藥，為我國常用大宗中藥材之一，具有止咳祛痰、潤腸通便等功效（中華人民共和國國家藥典委員會，2015）。羅漢果果實中的甜苷Ⅴ為世界上最強的非糖甜味物質(zhì)之一（李典鵬和張厚瑞，2000），在天然藥物和甜味劑開發(fā)方面受到廣泛關注。羅漢果分布于一個相對狹小的區(qū)域，資源匱乏已成為不爭的事實。羅漢果藥用和甜苷提取需求量的增加，推動了羅漢果種植業(yè)的空前發(fā)展，原產(chǎn)地被大量開墾發(fā)展羅漢果種植，導致野生資源儲備銳減；而人工栽培組培苗的推廣，使栽培方式由多年生變?yōu)橐荒晟岣弋a(chǎn)量的同時，卻導致栽培品種單一，品種退化嚴重。羅漢果在種植方面最突出的是品種問題，農(nóng)學和生物學工作者在羅漢果的高產(chǎn)栽培技術（陳繼富等，2012）、組織培養(yǎng)（付長亮等，2005）、多倍體育種（蔣水元等，2009）、新品種選育（馬小軍等，2008）、遺傳轉化研究（朱英芝，2012；邢愛佳等，2013；曾雯雯，2015）等方面已開展大量工作，并且選育出一系列優(yōu)良高產(chǎn)的新品種。到目前為止，利用雜交育種、誘變育種與優(yōu)良品種選育等常規(guī)方法還沒有取得突破性進展（閆海鋒等，2011）。當前所采用的栽培品種依然為20世紀70年代形成的青皮果、紅毛果等農(nóng)家品種。

航天育種具有誘變效率高、育種周期短、變異方向不定、可出現(xiàn)常規(guī)育種不易出現(xiàn)的變異等特點，近年來已經(jīng)受到廣泛關注，并取得了令人矚目的研究成果（劉錄祥等，2007；梁劍平，2010）。運用航天育種，可以提高羅漢果變異率，擴大種質(zhì)資源庫，創(chuàng)造更多供選擇的優(yōu)異種質(zhì)。2011年，一批羅漢果種子搭載“神舟八號”進行太空育種；2012年，這批種子在廣西桂林永?？h進行試種。ISSR分子標記技術，具有多態(tài)性高、操作簡單、價格低廉的優(yōu)點，具有較高的穩(wěn)定性和重復性（Zietkiewicz et al，1994）。本研究運用ISSR分子標記技術，首次在DNA層面，對航天羅漢果種質(zhì)進行遺傳變異檢測，探究太空環(huán)境對羅漢果造成的誘變效應，為羅漢果新品種的培育提供理論指導。

1材料與方法

1.1 材料

2014年春，將航天羅漢果種質(zhì)與主栽品種種植于廣西植物研究所本課題組試驗地，當年秋天采集葉片，共計28個樣本（表1），硅膠干燥保存。航天羅漢果標號以A和B開頭。主栽品種都為青皮果，航天種質(zhì)品種為冬瓜果。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取采用改良CTAB法（Doyle JJ & Doyle JL，1987），提取干燥葉片總DNA。提取步驟：稱取干燥葉片0.1 g，放入研缽中，加適量液氮，快速研磨成粉；在研缽中加入2 mL 預熱65 ℃ 2% CTAB（含2% β-巰基乙醇），研磨混合均勻；將溶液從研缽轉入2 mL 離心管中，65 ℃ 水浴1 h，期間每隔15 min上下顛倒混勻一次；12 000 r·min1離心10 min，上清液倒入新離心管；加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），上下顛倒混勻7 min。12 000 r·min1離心10 min，上清吸入新離心管；重復氯仿抽提一次； 加入1/10體積NaAc （pH 5.2）， 等體積異丙醇 （-20 ℃預冷），混勻，-20 ℃冰箱中靜置20 min；5 000 r·min1，5 min，倒上清液；加入1 mL 70%乙醇洗滌一次；5 000 r·min1，5 min，倒上清液，1 mL 無水乙醇洗滌2次；自然風干，加50 μL 1 × TE溶解；-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 DNA檢測運用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA完整性，用NanoDropTM/ND2000C檢測DNA濃度和純度。

1.2.3 ISSR引物及退火溫度篩選隨機選取8個樣本，對100個引物進行篩選。PCR試劑為TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase （Mg2+ free buffer）。25 μL PCR反應體系中含DNA模板50 ng，其余成分終濃度：1×buffer（不含Mg2+），MgCl2 2.0 mmol·L1，4種dNTPs 各0.2 mmol·L1，引物0.5 μmmol·L1，Tag酶1 U。反應程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min（周俊亞等，2004）。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)顯影、拍照。選擇條帶多、清晰、亮度強的引物進行引物退火溫度篩選。設置50～55 ℃溫度梯度，篩選退火溫度，用于28個樣本的ISSR分析。

1.2.4 ISSR數(shù)據(jù)分析ISSR擴增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫。在相同的遷移位置上，有帶存在賦值為“1”，無此帶賦值為“0”，用GenAlEx 6.5軟件（Peakall

& Smouse，2006；PE，2012）計算Neis （Nei & Li，1979）遺傳相似系數(shù)，采用NTSYSpc Version 2.10 e 軟件構建UPGMA聚類圖。

2結果與分析

2.1 DNA檢測

從圖1可以看出，DNA條帶亮度高、集中、清晰、無降解。DNA的濃度值在1 765.3～5 186.4 ng·μL1之間，λ260/280 在2.05～2.16之間，λ260/230在1.80～2.21之間。純DNA 的λ260/280 比值約為1.8，該比值受測量時空白樣品和DNA樣品所用溶劑的pH和例子強度影響：酸性溶劑的比值會低0.2～0.3，而堿性溶液比值會高0.2～0.3。如果偏差太大，則是蛋白、酚或其他污染在280 nm區(qū)域附近具有吸收峰；純DNA的λ260/230 比值為1.8～2.2。比值太低說明DNA提取技術需要優(yōu)化（Desjardins & Conklin，2010）。本研究中，溶解DNA所用試劑TE（pH8.0）為堿性，λ260/280值在正常范圍。因此，本研究所獲得的羅漢果DNA濃度高、質(zhì)量好，可以滿足ISSR分析的需要。

2.2 ISSR引物篩選及引物退火溫度篩選

從100個ISSR引物中篩選出17個引物，篩選的退火溫度見表2和圖2。

2.3 遺傳多樣性分析

17條引物在28個樣本中共擴增得到157條條帶，其中83條具有多態(tài)性，多態(tài)條帶百分率為52.87%；各引物擴增的條帶數(shù)最多為13條（U881），最少為6條（U808），平均為9.2條；各引物擴增的多態(tài)條帶最多為9條（U857），最少為3條（U808，U834，U835，U845，U889），平均為4.9條（表2）。

Neis遺傳相似系數(shù)范圍0.987～0.707，最大的為A1♀和BL2（0.987），最小的為B6和LG2。根據(jù)UPGMA聚類圖，28個羅漢果樣本可以分為3類，聚類Ⅰ為航天種質(zhì)B6和B3♀；聚類Ⅱ為航天種質(zhì)A1♀，A14，A18與主栽品種；聚類Ⅲ中都為航天羅漢果種質(zhì)（圖3）。

3討論與結論

我國通過航天育種已培育出一批具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病新品種（系），但相應的基礎理論研究較薄弱，需要加強航天誘變的分子基礎研究，解析誘變的分子機制，提高誘變的預見性和誘變后代選擇效率。本研究運用ISSR分子標記技術，從DNA層面，對航天羅漢果的變異進行解析。從100個ISSR引物中篩選得到17個引物，對28個羅漢果樣本進行擴增，共擴增出157個條帶，其中83條具有多態(tài)性，多態(tài)條帶百分率為52.87%；各引物擴增的條帶數(shù)最多為13條（U881），最少為6條（U808），平均為9.2條；各引物擴增的多態(tài)條帶最多為9條（U857），最少為

3條（U808，U834，U835，U845，U889），平均為4.9條；Neis遺傳相似系數(shù)范圍0.987～0.707，最大的為A1♀和BL2（0.987），最小的為B6和LG2；根據(jù)UPGMA聚類圖，28個羅漢果樣本可以分為3類，聚類Ⅰ為航天種質(zhì)B6和B3♀；聚類Ⅱ為航天種質(zhì)A1♀，A14，A18與主栽品種；聚類Ⅲ中都為航天羅漢果種質(zhì)。

航天誘變育種產(chǎn)生的變異率一般為5%～10%，往往從這些突變體中可以篩選到2%～3%的有益突變體材料（潘光輝等，2005）。本研究中，航天種質(zhì)品種為冬瓜果，主栽品種屬于青皮果，運用ISSR分子標記技術，可以從DNA層面區(qū)分這兩個品種，與周俊亞等（2005）的研究結果一致。青皮果是目前栽培面積最大的羅漢果品種（周俊亞和唐紹清，2006），具有甜苷含量高，大、中果占比高、產(chǎn)量高、適應性強等優(yōu)點（孫宗喜等，2006；白隆華等，2007）。本研究中，根據(jù)Neis遺傳相似系數(shù)構建的UPMG聚類圖表明，所有主栽品種聚為一類，與其品種分類一致，大多數(shù)航天羅漢果聚為一類，也與其品種來源一致；航天羅漢果A1♀，A14，A18與主栽品種聚為一類，暗示這3個種質(zhì)與其他航天種質(zhì)已產(chǎn)生了一定的遺傳分化，而具有與主栽品種更為相似的遺傳背景，可能獲得了有益突變。本研究結果可以指導航天育種后代的篩選，重點關注A1♀，A14，A18，結合農(nóng)藝性狀和化學成分方面的研究，從中篩選出優(yōu)良品系。

在雜交育種中，親本選擇的原則之一是親緣關系上存在一定差異，親本間差異越大，后代的雜交優(yōu)勢可能越明顯。根據(jù)Nei遺傳相似系數(shù)，可以獲得兩兩品種間的最大及最小相似度，指導后續(xù)的雜交育種工作，充分利用航天種質(zhì)，為羅漢果的遺傳改良引入新的優(yōu)良種質(zhì)。

參考文獻：

BAI LH， MA XJ， MO CM， et al， 2007. Study on quantitative assessment of Siraitia grosvenorii germplasms by general index [J]. Chin J Chin Mat Med， 32（23）：2482-2484. [白隆華， 馬小軍， 莫長明， 等， 2007. 羅漢果種質(zhì)資源綜合指數(shù)定量評價研究 [J]. 中國中藥雜志， 32（23）：2482-2484.]

CHEN JF， TIAN QJ， LIU SB， 2012. Effects of different cultivation modes on growth， fructification and fruit quality of Siraitia grosvenorii [J]. Chin J Trop Crops， 33（12）：2185-2189. [陳繼富， 田啟建， 劉世彪， 2012. 不同栽培方式對羅漢果生長、結果及品質(zhì)的影響 [J]. 熱帶作物學報， 33（12）：2185-2189.]

Chinese Pharmacopoeia Commission， 2015. Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China（Vol. I） [M]. Beijing：China Medical Science Press：324. [中華人民共和國國家藥典委員會， 2015. 中華人民共和國藥典（一部） [M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社：324.]

DESJARDINS P， CONKLIN D， 2010. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids [J]. J Vis Exp， （45）：e2565.

DOYLE JJ， DOYLE JL， 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull， 19：11-15.

FU CL， MA XJ， BAI LH， et al， 2005. Progress on research of tissue culture of Siraitia grosvenorii [J]. Chin J Chin Mat Med， 30（5）：325-328. [付長亮， 馬小軍， 白隆華， 等， 2005. 羅漢果組織培養(yǎng)研究進展 [J]. 中國中藥雜志， 30（5）：325-328.]

JIANG SY， JIANG XJ， QIN JS， et al， 2009. Preliminary study on selection of seedless Siraitia grosvenorii [J]. Guihaia， 29（4）：506-509. [蔣水元， 蔣向軍， 覃吉勝， 等， 2009. 無籽羅漢果選育的初步研究 [J]. 廣西植物， 29（4）：506-509.]

LI DP， ZHANG HR， 2000. Studies and uses of Chinese medicine Luohanguo——a special local product of Guangxi [J]. Guihaia， 20（3）：270-276. [李典鵬， 張厚瑞， 2000. 廣西特產(chǎn)植物羅漢果的研究與應用 [J]. 廣西植物， 2000， 20（3）：270-276.]

LIANG JP， LI XH， LU XH， et al， 2010. Application of nuclear irradiation to traditional Chinese medicine [J]. Nucl Physic Rev， 21（3）：284-290. [梁劍平， 李雪虎， 陸錫宏， 等， 2010. 核輻照技術在中藥領域中的應用 [J]. 原子核物理評論， 21（3）：284-290.]

LIU LX， GUO HJ， ZHAO LS， et al， 2007. Achievements in the past twenty years and perspective outlook of crop space breeding in China [J]. J Nucl Agric Sci， 21（6）：589-592， 601. [劉錄祥， 郭會君， 趙林姝， 等， 2007. 我國作物航天育種20年的基本成就與展望 [J]. 核農(nóng)學報， 21（6）：589-592， 601.]

MA XJ， MO CM， BAI LH， et al， 2008. A new Siraitia grosvenorii cultivar ‘Yongqing 1 [J]. Acta Hortic Sin， 35（12）：1855. [馬小軍， 莫長明， 白隆華， 等， 2008. 羅漢果新品種‘永青1號 [J]. 園藝學報， 35（12）：1855.]

NEI M， LI WH， 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases [J]. Proc Nat Acad Sci USA， 76（10）：5269-5273.

PAN GH， YIN XG， YANG QF， et al， 2005. Research progress on spaceflight breeding of crops [J]. SW Hortic， 33（4）：34-36. [潘光輝， 尹賢貴， 楊琦鳳， 等， 2005. 農(nóng)作物太空育種研究進展 [J]. 西南園藝， 33（4）：34-36.]

PEAKALL R， SMOUSE PE， 2006. GENALEX 6：genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research [J]. Mol Ecol Notes， 6（1）：288-295.

PEAKALL R， SMOUSE PE， 2012. GenAlEx 6.5：genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research—an update [J]. Bioinformatics， 28（19）：2537-2539.

SUN ZX， WANG YW， YOU M， et al， 2006. Comparison study on yield and quality in tissuecultured seedling of different Momordica grosvenori breed [J]. Biotechnol Bull， S1：521-524. [孫宗喜， 王有為， 尤敏， 等， 2006. 不同羅漢果品種組培苗產(chǎn)量與質(zhì)量性狀的比較研究 [J]. 生物技術通報， S1：521-524.]

XING AJ， MA XJ， MO CM， et al， 2013. Cloning and prokaryotic expression of UDPglycosyltransferase in Siraitia grosvenorii [J]. Acta Hortic Sin， 40（6）：1195-1204. [邢愛佳， 馬小軍， 莫長明， 等， 2013. 羅漢果葡萄糖基轉移酶基因的克隆及原核表達 [J]. 園藝學報， 40（6）：1195-1204.]

YAN HF， HUANG XY， LIANG P， et al， 2011. Comparative study on biological characteristics between diploid and polyploid Siraitia grosvenorii [J]. Guangxi Sci， 18（2）：177-180. [閆海鋒， 黃夕洋， 梁萍， 等， 2011. 二倍體與多倍體羅漢果生物學性狀的比較研究 [J]. 廣西科學， 18（2）：177-180.]

ZENG WW， 2015. Establishment of genetic transformation system for Siraitia grosvenorii and transformation research of CS gene [D]. Nanning：Guangxi University：15-53. [曾雯雯， 2015. 羅漢果遺傳轉化體系的建立與CS基因的轉化研究 [D]. 南寧：廣西大學：15-53.]

ZHOU JY， BING XY， PENG YT， et al， 2004. Establishment of ISSRPCR system in Luo Han Guo （Siraitia grosvenorii） [J]. J Guangxi Norm Univ （Nat Sci Ed）， 22（3）：81-84. [周俊亞， 賓曉蕓， 彭云滔， 等， 2004. 羅漢果 ISSRPCR 反應體系的建立 [J]. 廣西師范大學學報：自然科學版， 22（3）：81-84.]

ZHOU JY， TANG SQ， 2006. Genetic diversity of cultivated Luohanguo （Siraitia grosvenorii） revealed by RAPD markers [J]. Mol Plant Breed， 4（1）：71-78. [周俊亞， 唐紹清， 2006. 栽培羅漢果遺傳多樣性的 RAPD 分析 [J]. 分子植物育種， 4（1）：71-78.]

ZHOU JY， TANG SQ， XIANG WS， et al， 2005. Genetic diversity of cultivated Luohanguo （Siraitia grosvenorii） based on ISSR marker [J]. Guihaia， 25（5）：431-436. [周俊亞， 唐紹清， 向悟生， 等， 2005. 栽培羅漢果遺傳多樣性的 ISSR 分析 [J]. 廣西植物， 25（5）：431-436.]

ZHU YZ， 2012. Studies on Luohanguoinfecting Zucchihi yellow mosaic virus and genetic transformation system for Luohanguo [D]. Nanning：Guangxi University：71-92. [朱英芝， 2012. 小西葫蘆黃化花葉病毒羅漢果分離株及轉基因羅漢果的研究 [D]. 南寧：廣西大學：71-92.]

ZIETKIEWICZ E， RAFALSKI A， LABUDA D， 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics， 20（2）：176-183.