劉培衛(wèi) 張玉秀 楊云 陳波

摘要： 為比較沉香屬不同種植物間的葉片形態(tài)解剖特征，將不同來源的六種沉香屬植物在海南省興隆南藥園種植，運(yùn)用石蠟切片法和撕片法對其成熟葉片的解剖特征進(jìn)行觀察，并對葉片的上下表皮，葉脈和葉橫切面等12項(xiàng)數(shù)量性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：六種沉香屬植物葉片解剖結(jié)構(gòu)基本一致，均為典型的異面葉，由表皮、葉肉和葉脈組成，表現(xiàn)出典型的旱生形態(tài)特點(diǎn)。表皮細(xì)胞單層，氣孔微下陷，僅分布在下表皮，上下表皮上零星分布著表皮毛。葉肉組織發(fā)達(dá)，柵欄組織由1～2層排列緊密地圓柱狀細(xì)胞組成，其間分布著大量的長方晶體，海綿組織內(nèi)有一層排列較整齊，染色較深的異細(xì)胞組成的下皮層。主脈維管束雙韌型，呈圓環(huán)狀，內(nèi)含大量異細(xì)胞。方差分析表明，除柵海比外，葉片厚度、葉脈條數(shù)、主脈厚度等其余11項(xiàng)數(shù)量指標(biāo)在六種植物間差異均達(dá)到顯著水平。聚類分析將這六種植物聚成3類，Aquilaria sinensis（白木香），A. crassna和A. banaensis聚為一類，A. baillonii和A. malaccensis聚為一類；A. yunnanensis（云南沉香）單獨(dú)為一類 。該研究結(jié)果為沉香屬植物的物種鑒定提供了解剖學(xué)依據(jù)，同時(shí)對沉香屬植物合理開發(fā)利用具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 沉香屬， 比較解剖學(xué)， 葉片， 沉香

中圖分類號(hào)： Q944.56

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05056507

Abstract： Agarwood is a resin wood， which formed in the stem of Aquilaria and may represent the most prized nontimber forest product， which can be used in fragrances， incense， medicines， aromatherapy， and religious ceremonies. Aquilaria is an endangered genus due to the excessive exploitation of its precious agarwood， while not all Aquilaria species can produce agarwood effectively or different Aquilaria species produce agarwood with distinctive fragrances and price. Therefore， it is an important task to improve the identification methods of Aquilaria species. In order to identify the Aquilaria species， the leaf anatomical structures of selected Aquilaria species were compared in this study. The mature leaves of the six Aquilaria species （Thymelaeaceae） were studied with light microscopy and paraffin sectioning， and twelve quantitative traits of the leaves were measured and analyzed. The result showed that the leaf structures of six Aquilaria species were similar. All leaves showed the xerophytic feature. All leaves were typical bifacial type and were composed of epidermis， mesophyll and vein. The epidermis consisted of single layer epidermal cells. The upper epidermis were much thicker than the lower epidermis. The sunken stomata existed only in lower epidermis which was sporadically covered by hairs. The stomata were of anomocytic type. The mesophyll was well developed which were composed of palisade parenchyma， spongy parenchyma and lithocyst. The palisade parenchyma was composed of 1-2 layers of cylindrical cells， in which many rectangular lithocyst arranged perpendicularly to the epidermis. The hypodermis was located in spongy parenchyma， which was composed of idioblasts. The micrib belonging to bicollateral bundle was well developed. The bundle sheath and pith both contain a number of idioblasts. ANOVA analysis showed that the eleven quantitative traits were significantly different among six species， except for ratio of palisade to spongy tissue. Clustering analysis showed that six species were clustered into three main groups. Group 1 consisted of A. sinensis， A. crassna and A. banaensis； Group 2 consisted of A. baillonii and A. malaccensis； Group 3 only consisted of A. yunnanensis. The results provides some new information for the species identification， but also is of great significance for the conservation and utilization of Aquilaria spp.

Key words： Aquilaria， anatomical structure， leaf， agarwood

瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物為熱帶及亞熱帶常綠喬木，是生產(chǎn)珍稀沉香的最主要植物資源。全世界約有15種，分布于緬甸、泰國、越南、老撾、柬埔寨、印度東北部及不丹、馬來半島、蘇門答臘、加里曼丹等地（中國植物志編輯委員會(huì)，2004）。我國有沉香屬植物2種：白木香（A. sinensis）和云南沉香（A. yunnanensis）（中國植物志編輯委員會(huì)，2004），其中白木香是國產(chǎn)沉香的正品植物資源（國家藥典委員會(huì)，2015）。由于過度伐樹結(jié)香和自然環(huán)境的破壞，導(dǎo)致包括白木香在內(nèi)沉香屬野生資源瀕臨滅絕，目前沉香屬植物均被列入了《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄II（CITES，2004），其國際貿(mào)易必須在管制下進(jìn)行。

不同沉香樹種產(chǎn)生的沉香具有不同的香味和藥用屬性（Chen et al， 2012），因此不同沉香樹種間的經(jīng)濟(jì)價(jià)值差異較大。過去主要依據(jù)花和果實(shí)的特征對沉香屬植物進(jìn)行分類和鑒定（Lee et al， 2016），但這只能在開花結(jié)果期進(jìn)行。申彥晶等（2008）利用ISSR和ITS建立的系統(tǒng)樹得到的聚類結(jié)果相近卻不完全相同。Lee et al（2016）選擇trnLtrnF和ITS2組合對沉香屬進(jìn)行研究，獲得較好結(jié)果。為保證結(jié)果的可靠性，DNA條形碼鑒定必須和傳統(tǒng)的形態(tài)分類緊密結(jié)合起來。葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和蒸騰作用等生理代謝活動(dòng)的重要器官，葉片的解剖結(jié)構(gòu)特征與植物的遺傳特性及生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，常作為鑒定種質(zhì)的重要手段（常雪剛等，2011） 。趙翾和趙樹進(jìn)（2007）采用UPGMA法對國內(nèi)不同居群的白木香葉片形態(tài)特征進(jìn)行聚類分析，按照地理位置聚成4組。目前依據(jù)葉片微形態(tài)對沉香屬植物進(jìn)行分類和鑒定的研究未見報(bào)道。因此，本研究對引種到海南興隆熱帶藥用植物園的六種沉香屬植物葉片的解剖學(xué)特征做了比較和分析，旨在為沉香屬植物的物種鑒定提供解剖學(xué)依據(jù)，同時(shí)對沉香屬植物的合理開發(fā)利用具有重要的意義。

1材料與方法

1.1 材料

供試沉香屬六種植物見表1。供試材料均采自海南興隆熱帶藥用植物園沉香種植基地，2015年8月選取健康植株上完整成熟的葉片，在葉片1/2處取主脈及相鄰的側(cè)部，切成5 mm × 5 mm的小塊作為切片材料，每種取10個(gè)葉片。

1.2 方法

1.2.1 制片方法將切片材料固定于FAA溶液中，經(jīng)抽氣，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等過程制成蠟塊，Lecia RM2215石蠟切片機(jī)上切片，厚度

8 μm，番紅-固綠染色，加拿大樹膠封片。撕取上下表皮制成臨時(shí)裝片。

1.2.2 圖片采集和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在Nikon 80i型生物顯微鏡下觀察、拍照，測量其解剖結(jié)構(gòu)的數(shù)量性狀。測量指標(biāo)包括：葉片厚度、葉上下表皮細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、主脈厚度、氣孔密度。每個(gè)性狀測量20個(gè)數(shù)值。利用Microsoft Excel 2007和SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征

沉香屬六種植物葉片的上下表皮均由單層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不等，彼此間緊密嵌合（圖版Ⅰ、Ⅱ），上下表皮上具有較厚的角質(zhì)膜。上表皮細(xì)胞厚度明顯大于下表皮細(xì)胞厚度（表2）；上表皮細(xì)胞厚度總平均值為25.6 μm，其中A. crassna上表皮厚度最大（28.8 μm），顯著大于A. baillonii （23.8 μm）和A. yunnanensis（23.8 μm）。下表皮厚度總平均值為14.8 μm，變異系數(shù)為13.5%，其中A. crassna下表皮厚度最大（16.9 μm），顯著大于A. baillonii柬埔寨（11.9 μm）和白木香A. sinensis（13.5 μm）（表2）。氣孔僅分布在下表皮上，微下陷；保衛(wèi)細(xì)胞腎形，外圍由幾個(gè)普通表皮細(xì)胞不規(guī)則圍繞，無副衛(wèi)細(xì)胞（圖版Ⅱ）。氣孔密度約148個(gè)·mm2，變異系數(shù)為10.1%。氣孔密度除白木香和云南沉香間存在顯著差異外，其他植物間差異均不顯著（表2）。下表皮上還零星分布著由單個(gè)細(xì)胞形成的表皮毛（圖版Ⅱ：C，F(xiàn)）。

2.2 葉肉的結(jié)構(gòu)特征

六種沉香屬植物的葉肉組織主要由含有葉綠體的薄壁細(xì)胞組成，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和胞間隙的不同，分為柵欄組織和海綿組織（圖版Ⅲ）。柵欄組織緊貼上表皮，由1～2層排列比較緊密的長圓柱狀細(xì)胞構(gòu)成，染色較深（圖版Ⅲ：A-F）。海綿組織位于柵欄組織的下方，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，含有葉綠體較少，排列疏松，胞間隙大（圖版Ⅲ：A-F）。在六種沉香屬葉片中，柵欄組織總平均厚度為30.2 μm，變異系數(shù)為4.8%，其中A. banaensis柵欄組織最厚，為38.3 μm，顯著大于A. crassna（24.8 μm），A. malaccensis（28.3 μm）和A. yunnanensis（25.8 μm）柵欄組織的厚度（表2）；海綿組織厚度的平均值為104.6 μm，變異系數(shù)為8.6%，其中A. banaensis的海綿組織最厚（133.4 μm），顯著厚于其他5種沉香屬植物（表2）。植物柵欄組織與海綿組織的比值反映了柵欄組織的發(fā)育程度，比值越大，其柵欄組織越發(fā)達(dá)，越有利于植物的生長。通過多重比較發(fā)現(xiàn)，六種沉香屬植物柵海比總平均值為0.29，各種間差異不顯著（表2）。

除柵欄組織和海綿組織細(xì)胞外，在六種沉香屬植物葉肉細(xì)胞中我們均觀察到了下皮層和長方晶體（圖版Ⅲ：A-F）。下皮層緊貼下表皮，由一層排列較整齊，染色較深的異細(xì)胞組成（圖版Ⅲ：B，C，E，F(xiàn)）。長方晶體從上表皮開始，穿過柵欄組織，深入到海綿組織中部（圖版Ⅲ：A-F）。

2.3 葉脈的結(jié)構(gòu)特征

沉香屬植物的葉片為網(wǎng)狀脈，具有一條明顯的主脈，沿主脈分出多條纖細(xì)平行的側(cè)脈。六種沉香屬植物葉片主脈解剖特征類似，均為雙韌維管束（圖版Ⅳ：A-F）。在主脈橫切面上，被番紅染成紅色的圓環(huán)狀木質(zhì)部，由1～3列徑向排列的導(dǎo)管分子與1列木射線薄壁細(xì)胞相間排列構(gòu)成（圖版Ⅳ： A-F）。環(huán)狀木質(zhì)部外側(cè)為外生韌皮部，外生韌皮部中分布著染色較深的異細(xì)胞，在異細(xì)胞外側(cè)則是十分發(fā)達(dá)的成環(huán)狀排列的木質(zhì)部外纖維（圖版Ⅳ：A-F）。環(huán)狀木質(zhì)部內(nèi)側(cè)為較發(fā)達(dá)的內(nèi)生韌皮部。主脈的中心為大型的薄壁細(xì)胞和染色較深的異細(xì)胞組成的髓部（圖版Ⅳ）。統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)A. yunnanensis（云南）主脈最厚，約732.2 μm，與A. banaensis（535.0 μm）、A. crassna（610 μm）和A. sinensis（591 μm）存在顯著性差異（表2）。葉主脈維管束的高度平均為364.1 μm，寬度平均為502.7 μm，A. yunnanensis主脈維管束的高度和寬度顯著大于其他沉香屬植物（表2）。主脈維管束內(nèi)異細(xì)胞個(gè)數(shù)平均為8.9個(gè)，其中A. yunnanensis中顯著多于A. baillonii，A. crassna和A. banaensis。側(cè)脈總平均值為50條，A. yunnanensis的側(cè)脈條數(shù)最少為38條，顯著少于其他5種沉香植物（表2）。

2.4 聚類分析

利用SPSS軟件對葉片厚度，葉脈條數(shù)，主脈厚度，主脈維管束高度，主脈維管束寬度，表皮厚度，氣孔密度和柵欄與海綿組織的厚度及其比值等12個(gè)解剖學(xué)性狀數(shù)據(jù)（表3）進(jìn)行聚類分析， 可將六種沉香屬植物聚為3個(gè)組（圖版Ⅴ）。A. sinensis（白木香）、A. crassna和A. banaensis聚為一類；A. baillonii和A. malaccensis聚為一類；A. yunnanensis（云南沉香）單獨(dú)為一類 ，與以上兩組的距離較遠(yuǎn)。其中A. sinensis（白木香）和A. crassna關(guān)系最近。

3討論與結(jié)論

在適應(yīng)自然環(huán)境的過程中，植物逐漸演化出各種各樣的比較穩(wěn)定的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)（陳樹思和唐為萍，2005； 吳濤等，2013）。葉片是植物進(jìn)行光合作用、氣體交換及蒸騰作用的主要器官（胡正海，2010； 招禮軍等，2014），其所處環(huán)境的水分供應(yīng)情況和光照情況是影響葉片形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重要因素。因此，葉片結(jié)構(gòu)可以從一定程度上反應(yīng)植物對環(huán)境的適應(yīng)性和進(jìn)化機(jī)制（招禮軍等，2014） 。

沉香屬植物分布在多高溫、少低溫，多臺(tái)風(fēng)、干濕季分明，紫外線強(qiáng)的國家和地區(qū)，其葉片逐漸演化出適應(yīng)此種環(huán)境的結(jié)構(gòu)特征。六種沉香屬植物葉片的整體解剖結(jié)構(gòu)基本一致，為典型的異面葉，上下表皮各一層，表皮毛較少，柵欄組織1～2層，海綿組織中有較大的胞間隙，柵海比約為0.29，表現(xiàn)出中生植物的特點(diǎn)。六種沉香屬植物葉片都具有微下陷的氣孔、發(fā)達(dá)的輸導(dǎo)組織和內(nèi)生韌皮部，并含有大量的晶體和異細(xì)胞等，均表現(xiàn)出典型的旱生特征。

葉片表皮細(xì)胞排列緊密，具有較厚的角質(zhì)膜，可以防止熱帶亞熱帶地區(qū)高溫下水分的過度散失（陳樹思和唐為萍，2005），同時(shí)，還有助于沉香屬植物順利地度過降水稀少的干季。另外氣孔僅分布在下表皮上，且氣孔微下陷，都是抗旱性強(qiáng)的標(biāo)志（陳樹思和唐為萍，2005）。祁如虎等（1998）在研究高山植物時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)的異細(xì)胞在抵御干旱和短期低溫等方面具有重要的意義，同時(shí)在抵抗太陽輻射及強(qiáng)紫外輻射等方面也發(fā)揮著重要的作用，因此我們認(rèn)為沉香屬葉片內(nèi)大量存在的異細(xì)胞在抵御熱帶亞熱帶環(huán)境中強(qiáng)紫外輻射、干旱和短期低溫等方面發(fā)揮著一定的作用。植物體內(nèi)的晶體可以改變細(xì)胞的滲透勢，提高吸水和保水能力；同時(shí)晶體還與植物防御，解毒、光的聚集和反射等相適宜（朱廣龍等，2014）。因此葉表皮下長方晶體的存在，可能是沉香屬植物應(yīng)對強(qiáng)光，干旱和有害物質(zhì)等逆境的積極適應(yīng)方式。葉脈的主要功能是輸導(dǎo)和支持作用。在熱帶和亞熱帶地區(qū)， 植物葉脈中的內(nèi)生韌皮部對植

物抗拒水分過度散失具有一定的生態(tài)學(xué)意義（陳樹思和唐為萍，2005）。葉脈中大量存在的木質(zhì)部外纖維，可能是沉香屬植物積極應(yīng)對臺(tái)風(fēng)一種方式。

本研究中發(fā)現(xiàn)除柵海比外，葉片厚度，葉脈數(shù)，主脈厚度，主脈維管束的高度、寬度，上下表皮厚度，氣孔密度，柵欄組織和海綿組織的厚度等11項(xiàng)數(shù)量指標(biāo)在六種植物間差異均達(dá)到顯著水平。通過進(jìn)一步的聚類分析發(fā)現(xiàn)，A. sinensis（白木香）、A. crassna和A. banaensis親緣關(guān)系較近，聚為一類，A. baillonii和A. malaccensis聚為一類，A. yunnanensis與它們的關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)為一類。申彥晶等（2008）利用ITS序列聚類分析發(fā)現(xiàn)，A. sinensis與A. crassna聚為一類，A. yunnanensis與A. sinensis親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，而與A. rugosa親緣關(guān)系較近，這與本研究的結(jié)果比較相近。但是Lee et al（2016）綜合matK+tmLtmF+ITS2序列聚類分析表明A. sinensis和A. yunnanensis親緣關(guān)系較近，而與A. malaccensis的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上研究結(jié)果存在一定的差異，可能與取樣有關(guān)，也有可能與研究方法不同有關(guān)。下一步我們將收集更多的沉香屬植物，利用形態(tài)學(xué)，DNA條形碼和生物化學(xué)等多種技術(shù)深入研究沉香屬植物的親緣關(guān)系，對沉香屬植物進(jìn)行精確的分類和鑒定，為沉香屬植物資源的合理開發(fā)與保護(hù)等提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

CHEN HQ，WEI JH，YANG JS， et al， 2012. Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus Aquilaria plants [J]， Chem & Biodivers， 9（2）：236-250.

CHEN SS， TANG WP， 2005. Studies on anatomical structure of the leaves of Aquilaria sinensis [J]. J Trop & Subtrop Bot，13（4）：291-295. [陳樹思，唐為萍，2005. 白木香葉解剖結(jié)構(gòu)的研究 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，13（04）：291-295.]

CHANG XG，XU Z，YI J，et al， 2011. Comparison of leaf anatomical characteristics of six species of Roegneria [J]. Acta Agr sin， 19（3）：443-450. [常雪剛，徐柱，易津，等， 2011. 六種鵝觀草屬植物葉片形態(tài)解剖特征比較 [J]. 草地學(xué)報(bào)，19（3）：443-450.]

CITES， 2004. Amendments to Appendices Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ of CITES [R].

Editorial Board of Chinese Pharmacopoeia， 2015. Chinese Pharmacopoeia [M]. Beijing： Chinese Medicine Science and Technology Publishing House. [國家藥典委員會(huì)，2015. 中華人民共和國藥典（一部） [M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社.]

Flora of China Editorial Committee， 2004. Flora republicae popularis sinicae [M]. Beijing： Science Press， 52（1）：289. [中國植物志編輯委員會(huì)，2004. 中國植物志 [M]. 北京：科學(xué)出版社，52（1）：289.]

HU ZH， 2010. Plant anatomy [M]. Beijing： Higher Education Press. [胡正海，2010. 植物解剖學(xué) [M]. 北京：高等教育出版社.]

LEE SY， NG WL， MAHAT MN， et al， 2016. DNA Barcoding of the endangered Aquilaria （Thymelaeaceae） and its application in species authentication of agarwood products traded in the market [J]. PLoS ONE， 11（4）： e0154631.

LI HC，QIU ZJ， 2003. A review of studies of drought resistance in tree species and drought resistant forestation technology [J].World For Res， 16（4）：17-22. [黎祜琛，邱治軍，2003. 樹木抗旱性及抗旱造林技術(shù)研究綜述 [J]. 世界林業(yè)研究，16（4）：17-22.]

LIU YY，CHEN HQ，YANG Y， et al， 2013. Wholetree agarwoodinducing technique： an efficient novel technique for producing highquality agarwood in cultivated Aquilaria sinensis trees [J]. Molecules， 18（3）： 3086-3106.

QI RH，LI YZ，F(xiàn)AN JP， 1998. The idioblasts and their ecologial significance in the levaves of 16 alpine plants [J]. Acta Bot BorealOccident Sin，18（2）：270-276. [祁如虎，李有忠，范建平，1998. 16種高山植物葉片內(nèi)的異細(xì)胞及其生態(tài)學(xué)意義 [J]. 西北植物學(xué)報(bào)，18（2）： 270-276.]

SHEN ND， WEI MQ， MA WP， 2007. A comparative study on the leaf anatomical structure of 8 species in Syinga [J].J Qinghai Univ（Nat Sci Ed），25（3）：11-13. [沈?qū)帠|，韋梅琴，馬文萍，2007. 丁香屬植物葉片解剖結(jié)構(gòu)的比較研究 [J]. 青海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），25（03）：11-13.]

SHEN YJ， YAN P， ZHAO X， et al， 2008. Application of ISSR marker and ITS sequence to investigation of genetic variation of Aquilaria sinensis [J]. J S Chin Univ Technol， 36（12）：128-132. [申彥晶，嚴(yán)萍，趙翾，等. 2008. ISSR和ITS標(biāo)記在白木香遺傳變異研究中的應(yīng)用 [J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），36（12）：128-132.]

WU T， HAN MY，SIMA YK， et al， 2013. Comparative anatomy on the leaves of 27 species of 6 genera in Magnoliaceae [J]. J West Chin For Sci，42（6）：25-37. [吳濤，韓明躍，司馬永康，等，2013. 木蘭科6屬27種植物的葉片比較解剖學(xué)研究 [J]. 西部林業(yè)科學(xué)，42（6）：25-37.]

ZHAO LJ， ZHU LQ， HUANG SX， et al， 2014. Genetic diversity of leaves anatomical traits in different provenances of Liriodendron Chinense seedlings [J]. Guihaia，34（3）： 308-314. [招禮軍，朱栗瓊，黃壽先，等，2014. 不同種源鵝掌楸苗木葉解剖性狀的遺傳多樣性 [J]. 廣西植物，34（3）： 308-314.]

ZHAO X， ZHAO S， 2007. Phenotypic diversity of different Aquilaria sinensis （Lour.） Spreng. populations [J]. J S Chin Univ Technol， 35（4）：117-1223. [趙翾，趙樹進(jìn). 2007. 白木香群體的表型多樣性分析 [J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），35（4）：117-122.]

ZHU GL，MA Y， HAN L，et al， 2014. Current status of research on morphological structure， biological function and formation mechanism of plant crystals [J]. Acta Ecol Sin， 34 （ 22） ： 6429-6439. [朱廣龍，馬茵，韓蕾，等，2014. 植物晶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物功能及形成機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 34（22）： 6429-6439.]