李 琦 曹青云 肖順麗 王 敏 關(guān)亮俊 張宏桂

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2015級(jí)碩士研究生，北京 100102)

制劑與質(zhì)量控制

吳茱萸次堿的制備方法※

李 琦 曹青云 肖順麗 王 敏 關(guān)亮俊 張宏桂△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2015級(jí)碩士研究生，北京 100102)

目的 以吳茱萸為原料，研究簡(jiǎn)單、快速、高效的分離、純化吳茱萸次堿的制備方法。方法 采用85%乙醇提取，硅膠柱層析分離，甲醇重結(jié)晶純化吳茱萸次堿，薄層鑒別(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、核磁方法檢查純度。結(jié)果 吳茱萸次堿經(jīng)TLC檢查與對(duì)照品一致，無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度達(dá)98.5%以上，經(jīng)核磁鑒定。另外經(jīng)考察，確定色譜條件為Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)225、290、215、365 nm；流動(dòng)相乙腈-水溶液(50∶50)；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL/min。結(jié)論 吳茱萸次堿對(duì)照品已達(dá)到中藥質(zhì)量檢測(cè)用化學(xué)對(duì)照品技術(shù)要求，所采取的分離、純化方法簡(jiǎn)單、安全、可行性強(qiáng)，成本低、效率高，可用于吳茱萸藥材及其制劑的質(zhì)量控制。

生物堿類;吳茱萸;化學(xué);制備

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.Var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth. Var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)，散寒止痛，降逆止嘔，助陽(yáng)止瀉，用于厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸及五更泄瀉[1]。近代醫(yī)學(xué)研究證明吳茱萸有鎮(zhèn)痛[2]、安神[3]、抗菌[4]、降血壓[5]和抗缺氧[6]等藥理作用。吳茱萸含有多種化學(xué)成分，其中生物堿類成分是吳茱萸的主要活性成分[7]。吳茱萸次堿是吳茱萸的主要活性成分之一，具有增加冠脈血流量[8]，舒張血管、降血壓[9]，抗血小板聚集[10-11]，腦保護(hù)作用[12]，調(diào)節(jié)糖脂代謝[13]，抗癌、抗炎、抗?jié)?、松弛非血管平滑肌、抗缺氧等藥理作用[14]。昶國(guó)平等[15]分離周期長(zhǎng)，且用丙酮重結(jié)晶，危害性大。為了研究更簡(jiǎn)單、快速、高效的分離、純化吳茱萸次堿的制備方法，本試驗(yàn)用一次硅膠柱層析分離，甲醇重結(jié)晶的方法，高效率制得純度在98.5%以上的吳茱萸次堿。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 1525型高效液相色譜儀，Waters 2489型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器；色譜柱為Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；色譜純乙腈(Calipure進(jìn)口分裝)；吳茱萸藥材購(gòu)自云南昆明藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定為Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 裝柱 取200～300目硅膠1.5 kg溶于石油醚中，攪拌均勻后裝入層析柱(φ15 cm×60 cm的玻璃層析柱)。石油醚為流動(dòng)相，常壓沉降硅膠1周備用。

1.2.2 提取與分離 取吳茱萸藥材0.5 kg，用粉碎機(jī)稍加粉碎，裝入10 L圓底燒瓶中，用10倍量石油醚脫油脂1次(2 h)，趁熱過(guò)濾，得殘?jiān)蜑V液，濾液回收石油醚，殘?jiān)俅畏湃雸A底燒瓶中，用10倍量85%乙醇提取3次，每次2 h，合并3次提取液。將提取液濃縮至無(wú)醇味。加適量水，有大量沉淀析出，過(guò)濾，得黑綠色沉淀物101.12 g，于通風(fēng)櫥中揮干溶劑，減壓干燥箱中干燥(55 ℃)24 h，研缽中研磨。細(xì)粉過(guò)80目篩后，直接干法上樣，用石油醚-乙酸乙酯(v∶v,5∶1)洗脫，按照1滴/s的流速收集流分于圓底燒瓶中，500 mL后換瓶，流分至5 000 mL后開(kāi)始有白色雪花狀結(jié)晶析出，為吳茱萸次堿粗品。結(jié)合色帶顏色收集流分，收集液(40 ℃)減壓回收溶劑后，點(diǎn)硅膠板合并有相同目標(biāo)物的流分。常溫放置一段時(shí)間后得黃白色粗品1.2 g。

重結(jié)晶：將粗品用甲醇溶解成過(guò)飽和狀態(tài)，放入冰箱中，低溫重結(jié)晶，如此反復(fù)3次，干燥后即淡黃色吳茱萸次堿純品0.5 g。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR(500 MHz, CDCl3)，δ: 9.606(1H, br s, N-H-1), 8.327(1H, dd, J=1.5 Hz, J=8.0 Hz, H-19),7.763(1H, dt, J=1.5, J=8.0 Hz, J=8.5 Hz, H-17), 7.440(1H, d, J=8.0 Hz, H-16), 7.426(1H, d, J=8.0 Hz, H-9), 7.410(1H, d, J=8.5 Hz, H-12), 7.342(IH, d, J=8.0 Hz, H-18), 7.306(1H, t, J=8.0, 7.0 Hz, H-11), 7.147(1H, t, J=7.5, 7.5 Hz, H-10), 4.594(2H, t, J=7.0, 7.0 Hz,H-5), 3.239(2H, t, t=7.0, 6.5 Hz, H-6)，與文獻(xiàn)的吳茱萸氫譜數(shù)據(jù)吻合[16]。

1.2.4 純度測(cè)定

1.2.4.1 TLC檢測(cè) 分別以石油醚-丙酮(5∶1)、石油醚-正丁醇(6∶1)、石油醚-乙酸乙酯(5∶2)為展開(kāi)劑進(jìn)行硅膠薄層層析。紫外燈365 nm下觀察樣品與對(duì)照品Rf比對(duì)。

1.2.4.2 高效液相色譜法 色譜條件，色譜柱：Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水溶液 (50∶50)，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]中的規(guī)定進(jìn)行等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：225、290、215、365 nm；柱溫：35 ℃。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按照吳茱萸次堿峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

取吳茱萸次堿適量，加甲醇溶解制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作為供試品，然后取空白溶劑(甲醇)和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測(cè)定。

1.2.5 色譜條件考察

1.2.5.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 《中華人民共和國(guó)藥典》[1]吳茱萸次堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，將215 nm作為吳茱萸次堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。為了使吳茱萸次堿純度確信，又選擇225、290、365 nm檢測(cè)波長(zhǎng)[17-18]。

1.2.5.2 流量的考察 取吳茱萸次堿供試液適量，分別設(shè)置體積流量為0.8、1.0、1.2 mL/min，進(jìn)行考察。

1.2.5.3 色譜柱的考察 取吳茱萸次堿供試液適量，以檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm、柱溫35 ℃、流動(dòng)相甲醇-水(80∶20)、體積流量1 mL/min、進(jìn)樣量10 μL為色譜條件，分別采用Sunfire TM C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)、Agilent C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5.4 柱溫的考察 取吳茱萸次堿供試液適量，分別設(shè)置柱溫為25、30、35 ℃，進(jìn)行考察。

2 結(jié) 果

2.1 TCL檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)3個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)方式檢測(cè)時(shí)，TLC上均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，而且未見(jiàn)雜質(zhì)，且樣品與對(duì)照品Rf相同。

2.2 HPLC檢測(cè)結(jié)果 扣除溶劑干擾峰后，吳茱萸次堿的色譜峰面積歸一化含有量在各波長(zhǎng)均>99%，相應(yīng)的樣品與對(duì)照品出峰時(shí)間一致，在各個(gè)波長(zhǎng)下的含量分別為215 nm的純度為98.5%，在295 nm的純度為99.1%，茱萸次堿225 nm的純度為99.4%，在365 nm的純度為99.6%說(shuō)明樣品的純度符合化學(xué)對(duì)照品的質(zhì)量要求，如圖1所示。

注：(a)215 nm (b)225 nm (c)295 nm (d)365 nm

2.3 流量考察的結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 流量研究結(jié)果

由表1可見(jiàn)，當(dāng)體積流量為1.0 mL/min時(shí)，對(duì)稱因子和理論塔板數(shù)最高。

2.4 色譜柱考察結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 色譜柱考察結(jié)果

由表2可知，當(dāng)色譜柱為HederaC18(4.6 mm×200 mm，5 μm)時(shí)，對(duì)稱因子和理論塔板數(shù)最好。

2.5 柱溫考察結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 柱溫考察結(jié)果

由表3可知，當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)，基線穩(wěn)定，對(duì)稱因子最高。

3 討 論

本方法在短時(shí)間里，應(yīng)用簡(jiǎn)單且毒害低的提取分離方法，從吳茱萸中分離出符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)[1]標(biāo)準(zhǔn)的吳茱萸次堿對(duì)照品，而且路線簡(jiǎn)單可靠，可用于吳茱萸藥材及其制劑的質(zhì)量控制。

3.1 提取前的準(zhǔn)備工作 吳茱萸含有很多小分子的脂溶性成分[19]，直接用乙醇提取，提取溶液特別黏稠，增加分離工作的負(fù)擔(dān)，不利于后期處理。實(shí)驗(yàn)用乙醇提取之前，用石油醚脫脂，既減少油脂雜質(zhì)，又為后期分離減輕工作量。

3.2 樣品的處理 濃縮得到墨綠色沉淀后，昶國(guó)平等[15]選用二氯甲烷加熱溶解，本試驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上選擇用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇以及甲醇與乙酸乙酯混合溶劑加熱溶解，溶解度都非常小，浪費(fèi)了大量的溶劑和時(shí)間，且二氯甲烷沸點(diǎn)低且毒性較大，導(dǎo)致頭暈、頭痛、惡心、嘔吐、手腳麻木、疲勞、協(xié)調(diào)性降低以及眼和上呼吸道刺激癥狀，高濃度暴露可能導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)、意識(shí)喪失甚至死亡[20]，增加了試驗(yàn)的不安全性。本試驗(yàn)最后采用樣品直接上柱法，沉淀烘干后，打粉，過(guò)篩，上柱，免去硅膠分散干膏粉的傳統(tǒng)工序，既節(jié)約試劑，又節(jié)約時(shí)間。在保證分離效果的前提下簡(jiǎn)化了分離工藝，節(jié)省了試劑和時(shí)間，提高了分離效率，降低了生產(chǎn)成本，保證試驗(yàn)的安全有效。

3.3 甲醇重結(jié)晶 昶國(guó)平等[15]采用丙酮重結(jié)晶，而本試驗(yàn)采用甲醇重結(jié)晶。丙酮在應(yīng)用中極易發(fā)生泄漏、中毒、火災(zāi)、爆炸及環(huán)境污染等事故，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的麻醉作用，出現(xiàn)乏力，惡心，頭痛，頭暈，易激動(dòng)，重者發(fā)生嘔吐、氣急、痙攣，甚至昏迷，對(duì)眼、鼻、喉有刺激性[21]。用甲醇重結(jié)晶，一方面重結(jié)晶的次數(shù)減少，縮短了結(jié)晶的時(shí)間，另外減少對(duì)環(huán)境的污染，控制一些可變因素，增加試驗(yàn)的安全性。

3.4 波長(zhǎng)的考察 昶國(guó)平等[15]用雙波長(zhǎng)檢測(cè)吳茱萸次堿，225 nm的純度為98.5%，在290 nm的純度為98.8%。鮑天冬等[17]研究用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定制吳茱萸及其提取物中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯含量，選取225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。王世永等[18]研究吳茱萸中吳茱萸堿和次堿的提取及測(cè)定，選取290 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。而本試驗(yàn)選取225、290、215、365 nm 4個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)，更能準(zhǔn)確地反映真實(shí)純度。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:171.

[2] 李曉宇,孫蓉.基于胃寒證的吳茱萸水提物鎮(zhèn)痛及伴隨毒副作用機(jī)制[J].中國(guó)中藥雜志,2015,40(14):2753-2759.

[3] 蘆霜,盧昕,陳民.加味吳茱萸散穴位貼敷治療老年失眠臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(12):2416-2417.

[4] 喬海霞,甄攀,李秀娟,等.吳茱萸提取物體外抗菌作用初步研究[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2009,26(1):27-29.

[5] 趙曉麗,李德森,吳水生,等.澤瀉吳茱萸方對(duì)血管活性物質(zhì)降血壓作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,13(8):204-206.

[6] 張明發(fā),沈雅琴,許青媛.附子和吳茱萸對(duì)缺氧和受寒小鼠的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),1990,2(1):23-27.

[7] 龍明立,張毅民,賀麗平,等.吳茱萸次堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(6):528-531.

[8] Hu CP, Xiao L, Deng HW, et al.The cardiopmtectionof Rutaecaepine is mediated by endogenous calcitonin related-gene peptide through activation of vanillinreceptors inguinea- pig hearts[J].Planta Med, 2002,68(8):705-9.

[9] Yu J, Tan GS, Deng PY, et al. Involvement of CGRP in the inhibitory effect of rutaecarpine on vasoconstriction inducedby anaphylaxis in guinea pig[J].Regulatory Pept, 2005,125(1-3):93-97.

[10] Sheu JR, Hung WC, Lee YM, et a1. Mechanism of inhibition of platelet aggregation by rutaecarpine, an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa[J].Eur J Pharmacol,1996,318(2-3):469-475.

[11] Sheu JR, Kan YC, Hung WC,et al.The antiplatelet activity of rutaecarpine, an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa, is mediated through inhibition of phospholipase C[J].Thromb Res,1998,92(2):53-64.

[12] 嚴(yán)春臨,張季,高艷青,等.吳茱萸次堿對(duì)腦缺血再灌注小鼠的保護(hù)作用及作用機(jī)制研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(6):264-266.

[13] 李瑩瑩.吳茱萸次堿通過(guò)激活CAR調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)制及其藥動(dòng)學(xué)研究[D].杭州：浙江大學(xué),2016.

[14] 蔡雪映,孟楠,楊冰.服用吳茱萸過(guò)量致中毒1例分析[J].北京中醫(yī),2006,25(3):171-172.

[15] 昶國(guó)平,魏雅蕾,楊玉琴,等.吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備方法[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2015,29(2):36-37.

[16] 孟娜,陳鳳凰,惠斌,等.吳茱萸化學(xué)成分研究[J].貴州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2006,23(2):188-190.

[17] 鮑天冬,董宇,楊慶,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定制吳茱萸及其提取物中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007,13(6):1-3.

[18] 王世永,李小定.吳茱萸中吳茱萸堿和次堿的提取及測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(3):340-342.

[19] 崔曉秋.吳茱萸化學(xué)成分研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[20] 王海蘭.二氯甲烷的職業(yè)危害與防護(hù)[J].現(xiàn)代職業(yè)安全,2013,(8):107-109.

[21] 王晶晶,陸書(shū)明.丙酮的工業(yè)安全應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].廣東化工,2014,41(12):279-280.

(本文編輯：董軍杰)

Preparation method of rutaecarpine

LIQi,CAOQingyun,XIAOShunli,etal.

2015-GradeMasterofChineseMedicineCollegeinBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100102

Objective Using evodia as the material, to study a simple, rapid and efficient preparation method for the separation and purification of rutaecarpine. Methods The rutaecarpin were prepared by using 85% ethanol extraction, silica-gel column chromatography separation and methanol recrystallization purification. The purity was checked by thin layer identification (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and nuclear magnetic resonance (NMR). Results Rutaecarpine was consistent with the reference substance upon TLC, without impurities and spots, the purity over 98.5% upon HPLC, which identified by NMR. In addition, the chromatographic conditions were determined as Waters C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm), determine wavelengths: 225, 290, 215, 365 nm; moving phase: acetonitrile-aqueous solution (50∶50); sample size: 10 μL; column temperature: 35 ℃; volume flow rate: 1.0 mL/min. Conclusion Rutaecarpine reference substance has reached the technical requirements of Traditional Chinese medicine with chemical reference materials, the method for separation and purification is simple, safe, strong feasibility, low cost, high efficiency, can be used for the quality control of evodia medicinal materials and its preparations.

Alkaloids; Evodia; Chemistry; Preparation

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.031

※ 項(xiàng)目來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30870262)

李琦(1991—)，女，碩士研究生在讀。研究方向：中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R282.71;R284.1

A

1002-2619(2017)03-0439-05

2017-01-13)

△ 通訊作者：北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院科技發(fā)展部，北京 100102